Diapositiva 1

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STUDIO ESPRESSIONE GENICA
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I meccanismi di controllo usati per regolare
lespressione dei geni umani devono essere molto
più complessi da quelli utilizzati dagli altri
organismi.

• Regolazione trascrizionale
• Regolazione post-trascrizionale
• Meccanismi epigenetici e controllo
• dellespressione genica a lunga distanza

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Cellula umana contiene circa 30000 geni
RNA genes
Geni per proteine
Ogni cellula in un determinato momento esprime
solo una piccola parte di questo potenziale (
5000 geni)
Geni housekeeping Geni tessuto -
specifici metabolismo biosintesi membrana istoni
ribosomali
DIFFERENZIAMENTO CELLULARE

A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE
(IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA
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Esistono molteplici livelli di regolazione
dellespressione genica negli eucarioti
NUCLEO
DNA
Meccanismi epigenetici controllo a lungo raggio
mediante rimodellamento della struttura della
cromatina
controllo trascrizionale legame di fattori
trascrizionali tessuto specifici, legame diretto
di ormoni, fattori di crescita o elementi
intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili
Trascritto primario (precursore)
controllo post-trascrizionale splicing
alternativo, polyA alternativo, RNA editing
tessuto-specifico
mRNA
controllo del trasporto
CITOPLASMA
mRNA
controllo traduzionale
controllo della stabilità
traduzione
degradazione
PROTEINA
controllo post-traduzionale
PROTEINA attiva o inattiva
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Meccanismi epigenetici

• Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma
  che non sono direttamente attribuibili alla
  sequenza del DNA.
• Metilazione del DNA
• Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a
  carico della C. Solo il 3 delle C sono metilate
  ed in genere è bersaglio della metilazione la C
  della doppietta CpG.
• Modificazioni degli istoni
• Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni,
  responsabili di cambiamenti conformazionali della
  cromatina.

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Meccanismi epigenetici Metilazione del DNA
La metilazione del DNA è un processo
post-replicativo. Lestensione delle
modificazioni riguardanti la metilazione del DNA
è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La
metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi
correlati con il differenziamento cellulare,
tramite linibizione dellespressione genica a
livello trascrizionale.
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Quali regioni sono bersaglio della metilazione?

• I geni dei vertebrati attivamente trascritti sono
  marcati da isole CpG al 5. In queste regioni
  la frequenza di CpG è uguale a quella attesa nel
  DNA totale (40 GC), nella restante parte del
  genoma è invece più bassa del 20 rispetto
  allatteso
• Nel genoma umano il 56 dei geni sono associati a
  isole CpG tutti i geni housekeeping ed il 40
  dei geni con espressione tessuto-specifica
• I geni tessuto-specifici sono metilati in CpG
  nei tessuti dove non sono espressi

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Repressori e attivatori possono dirigere la
deacetilazione/acetilazione degli istoni a
livello di specifici geni
Importanza della struttura modulare e delle
interazioni proteina-proteina
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Meccanismi epigenetici Modificazioni degli
Istoni
I residui amminoacidici allN-terminale di
ciascun istone (20-60 residui) si estendono al di
fuori della superficie del nucleosoma.Queste
regioni sono particolarmente ricche in lisina (K)
che può essere reversibilmente modificata
mediante acetilazione, fosforilazione e
metilazione.
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Modificazioni degli istoni H3 e H4
La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che
metilata. Lacetilazione è associata alla
cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la
regione cromatinica viene metilata a livello del
DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA
metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che
rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi
istoniche, legate alle CpG binding protein,
metilano gli istoni. Il risultato è la
condensazione della cromatina.
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CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA
Trascrizione inattiva
Trascrizione attiva
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Controllo Trascrizionale
Il metodo principale col quale avviene il
controllo dellespressione genica negli
eucarioti è una trascrizione selettiva, che si
ottiene grazie a specifiche DNA binding
proteins.
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Diversamente dai procarioti, la trascrizione dei
geni eucarioti e controllata da numerosi elementi
Perche?
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• Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi
  al promotore prima che possa farlo la RNA
  polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà
  iniziare la trascrizione dipenderà anche dal
  legame di proteine regolatorie, attivatori e
  repressori.

Promotore basale
Elementi prossimali
Elementi distali
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Il promotore del gene umano dellinsulina
Nero fattori ubiquitari Rossi fattori specifici
delle cellule beta pancreatiche
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Il complesso trascrizionale dellRNA polimerasi
II viene assemblato a tappe successive (in vitro)
TBP TAFsTFIID
Lodish
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(No Transcript)
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Esempio di come i diversi elementi di controllo
di un gene possono integrarsi a livello del
promoter core
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Classi di fattori trascrizionali

• Zinc finger ( motivo a dita di zinco)
• Leucine zipper (serratura a leucina)
• homodomain (omodomini) assomigliano
  strutturalmente a regolatori batterici di tipo
  helix-turn-helix
• Helix-loop-helix (elica-ansa-elica). Le proteine
  appartenenti a questa classe, anche nota come HLH
  possono formare omo o etero-dimeri
• Recettori steroidei

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Consensus response element (RE) Response to Protein factor which recognizes RE


(T/G)(T/A)CGTCA cAMP CREB (also called ATF)
CC(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)GG Serum growth factor Serum response factor
TTNCNNNAAA Interferon-gamma Stat-1
TGCGCCCGCC Heavy metals Mep-1
TGAGTCAG Phorbol esters AP1
CTNGAATNTTCTAGA Heat shock HSP70, etc.
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Metodi per studiare i fattori trascrizionali

• EMSA
• DNA footprinting
• Trasfezioni transienti
• Geni reporter

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Gel Mobility Shift Assay (Electrophoresis
Mobility Shift Assay, EMSA)
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DNA Footprinting
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(No Transcript)
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Saggio per la Beta-galattosidasi
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CAT
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Luciferasi
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(No Transcript)