The facts and factors of transcription regulation

1
Promotori eucariotici
RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II
trascrive mRNA per proteine RNA pol III
trascrive tRNA e 5S rRNA
2
LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI?
Transcribed region
Promotore -contiene sequenze Specifiche per il
legame della polimerasi
3
FATTORI DI TRASCRIZIONE
FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) -
RICONOSCONO ELEMENTI core promoter
REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI -
REPRESSORI
Basal factor binding sites
Transcribed region
ELEMENTO ENHANCER
ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE
4

• Il legame promotore RNA polimerasi
• richiede i fattori di trascrizione generali

5
Promotori
6
COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
ATTIVITA
100
Reporter gene
eg CAT, luciferase
100
Reporter gene
20
Reporter gene
1
Reporter gene
0
Reporter gene
7
COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
ATTIVITA
100
Reporter gene
eg CAT, luciferase
100
Reporter gene
400
Reporter gene
1
Reporter gene
0
Reporter gene
8
attivato
basale
Livello di trascrizione
represso
9
Elementi del Core promoter siti di legame per
I fattori di trascrizione generali Che supportano
un livello di trascrizione basale
La regolazione della trascrizione e ottenuta
dalla Azione di fattori di trascrizione
gene-specifici
Transcribed region
10
RNAP II
Inr
DPE
TATA
BRE
24bp
TATA-box
8 bp elemento ricco in AT
Bound by TFIID
BRE
6 bp elemento ricco in purine
Bound by TFIIB
Inr
DPE
Bound by TFIID
11
TFIIF
2 subunits
2 subunits
RNAP II
TFIIA
2-3 subunits
12 subunits
10 subunits
TFIIB
1 subunit
40 polipeptidi
9 subunits
12
RNAP II
Inr
DPE
TATA
BRE
24bp
TATA-box
8 bp AT
lega TFIID
BRE
6 bp
lega TFIIB
Inr
DPE
lega TFIID
13
(No Transcript)
14
(No Transcript)
15
(No Transcript)
16
TFIIA
17
(No Transcript)
18
TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP
TFIID
19
TFIID e composta da vari TBP Associated
Factors TAFs
-aiutano il posizionamento di TFIID
riconoscendo Lelemento Inr -legano i fattori di
trascrizione gene specifici -aiutano a
decompattare la cromatina
20
(No Transcript)
21
TFIIA
TFIIA
-aumenta e stabilizza il legame di TBP al
DNA -interagisce con vari attivatori gene
specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF
22
TFIIB
TFIIA
-si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecip
a alla selezione del sito dinizio e Stabilisce
la direzione
23
TFIIF
TFIIA
Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una
torsione nel DNA
24
TFIIE
TFIIA
Attira una elicasi ed insieme srotolano
il Promotore. Stimola lattivita chinasica di
TFIIH
25
TFIIH
TFIIA
Fosforila una delle subunita della
polimerasi dando lavvio alla trascrizione
26
(No Transcript)
27
Regolatori gene specifici
hanno una struttura modulare contengono
un dominio che lega il DNA contengono uno o
piu domini di attivazione trascrizionale
qualche volta contengono uno o piu domini di
repressione qualche volta contengono un
dominio di dimerizzazione
28
(No Transcript)
29
(No Transcript)
30
(No Transcript)
31
(No Transcript)
32
(MADS box)
33
H
N
H
Donatore
Accettore
34
A D A M A
A D M A D
A D A A
A A A D
A A
A A D A
35
Regolatori gene specifici

• Contengono un dominio che lega il DNA
• E un dominio di attivazione trascrizionale

Transcribed region
36
Gli Attivatori come influenzano la trascrizione
di un gene distante molte migliaia di nucleotidi?
37
Enhancers- stimolano la trascrizione

• Attivatori si legano ad un sito specifico
• Il DNA si ripiega

38
Enhancers- stimolano la trascrizione

• Attivatori si legano ad un sito specifico
• Il DNA si ripiega
• Si forma il complesso nel promotore

39
Enhancers- stimolano la trascrizione

• Attivatori si legano ad un sito specifico
• Il DNA si ripiega
• Si forma il complesso nel promotore
• Si lega la RNA polimerasi
• Inizio della trascrizione

40
Controllo combinatorialedellespressione genica
41
Con poche proteine regolatorie si possono
controllare un elevato numero di geni
Diverse combinazioni producono fenotipi differenti
42
Heterodimerization of DNA binding proteins can
alter their sequence specificity
43
Enhancer e Repressori
promotore
enhancer
gene
10-50,000 bp
repressore
44
Recettori nucleari

• Fattori di trascrizione regolati da molecole
  idrofobiche
• Cambio dellattivita
• Cambio della localizzazione cellulare

45
Recettori nucleari
Il legame del ligando causa cambiamenti
conformazionali
RGRACANNNTGTYCY
46
Nuclear Receptors
Legame dellormone
Dissociazione da hsp90
GR
hsp90
dimerizzazione
Migrazione nel nucleo
Legame al DNA
47
Regolazione mediante fosforilazione

• Ormoni attivano una chinasi
• La chinasi fosforila un fattore di trascrizione
• Il fattore e attivato

48
Cascata delle chinasi
GF si lega al recettore - protein tyrosine
kinase Il recettore dimerizza
Il complesso fosforila MEKK (MAP kinase kinase
kinase)
MEKK fosforila SEK una MAP kinase kinase
SEK fosforila JNK una MAP kinase
49
Cascata delle chinasi
JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il
fattore di trascrizione C-JUN
C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 AP-1
attiva la trascrizione legandosi a TGA(C/G)TCA-
e interagendo con I fattori di trascrizione
generali
nucleo
TRE
50
(No Transcript)
51
Metilazione del DNA

• La citosina puo essere metilata

• La metilazione del DNA e coinvolta
  nellinattivazione del cromosoma X

52
Trascrizione e struttura della cromatina

• Il DNA nella cromatina condensata non e
  accessibile
• La cromatina condensata (eterocromatina) e
  trascrizionalmente silente
• La condensazione della cromatina dipende ANCHE
  dalla acetilazione degli istoni

53
Acetilazione degli Istoni

• E una modificazione post-traduzionale
• Gruppi acetilici (CH3COO) legati covalentemente
  a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche
  positive
• Eliminano le interazioni ioniche con il DNA
• Diminuiscono la condensazione
• Associati con una attiva trascrizione

54

• Acetilazione/Deacetilazione

55
Attivatori acetilazione degli Istoni

• Alcuni attivatori attirano delle acetilasi
• Il macchinario di trascrizione puo accedere
• al DNA meno condensato

56
Alcune Istone Acetilasi (HAT)

• p300/CBP
• TAF II 250
• Ambedue sono dei co-attivatori
• SAGA e a ponte tra un Fattore di Trascrizione e
  la TBP

57
Repressori deacetilazione degli Istoni

• Alcuni repressori attirano delle deacetilasi
• Prevengono laccesso del macchinario di
  trascrizione al DNA

58

• Acetilazione/Deacetilazione

59
SWI/SNF in Lievito
SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO
(accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del
saccarosio).
Queste proteine catalizzano il rimodellamento
ATP-dipendente del DNA
60
Macchinari di Rimodellamento

• Tutti contengono subunita simili a swi-2/snf
• NTP-binding proteins

61
(No Transcript)
62
(No Transcript)
63
Regolazione dellEspressione Genica

• Puo essere regolata in una delle seguenti sei
  fasi

inactive mRNA
NUCLEUS
CYTOSOL
degradazione
DNA
mRNA
mRNA
RNA transcript
trascrizione
Maturazione
trasporto
traduzione
protein
controllo dellattivita
inactive protein
64
Lo Splicing puo produrre anticorpi solubili o
legati alla membrana dallo stesso gene

• Lo splicing alternativo puo produrre due tipi di
  anticorpo diversi con la stessa specificita
• Quando attivati dallantigene i linfociti B
  cominciano a produrre anticorpi solubili
• Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che
  codificano per domini idrofobici

65
LRNA Editing altera le sequenze dei pre-mRNA
Figure 11-39
66

• mRNA editing

Nel fegato
La deaminasi e presente solo nellintestino
Nellintestino
67
Metodi per studiare lespressione dei geni

• Northern blot
• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR)
• Ibridazione In situ
• Trascrizione In vitro
• DNA Microarray

68
Purificazione dellRNA

• Procedura
• Lisi delle cellule con un reagente che dissocia
  le nucleoproteine e inibisce la RNAsi
• Rimozione delle proteine
• Precipitazione specifica dellRNA

69
Northern blot

• Per determinare la dimensione e la quantita di
  specifici mRNA
• Studi sullespressione genica

70
Northern blot

• Elettroforesi dellRNA in gel contenente
  formaldeide per mantenere lRNA in forma
  completamente lineare
• Trasferimento dellRNA su una membrana
• Ibridazione con una sonda marcata

71
(No Transcript)
72

Gel Elettroforesi- Separa le
molecole in base alla dimensione

73
Trasferimento su supporto solido
74
Trasferimento dal gel alla membrana
75
Dopo il trasferimento
gel
membrana
76
Preparare la sonda per il Northern Blot
77
Ibridazione

• La sonda marcata e aggiunta ad una soluzione
  contenente il supporto solido che lega lRNA da
  analizzare

78
Lavaggio

• Rimozione della sonda non legata al supporto
  solido

79
Rivelazione degli ibridi

• Esposizione di un film se la sonda e marcata
  radioattivamente
• Se la sonda e marcata con un enzima si procede
  alla reazione enzimatica che produce colore
  direttamente sul supporto solido

80
(No Transcript)
81
Northern blot

• La rivelazione avviene usando
• DNA marcato con radioattivo(32P)
• DNA marcato con un enzima che catalizza una
  reazione che produce luce o colore

82
Northern blot
Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae
total RNA from leaves (L), germinating seeds
(Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was
hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and
ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows
ethidium bromide staining of the gel before
blotting. The numbers to the left indicate
approximate transcript sizes in kb
83
Svantaggi del Northern Blot

• Richiede grandi quantita di RNA
• E un processo lungo e laborioso

84
Ibridazione dellRNA in situ
Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi
su vetrini da microscopio
Preparation of RNA probe with in vitro
transcription
T7/T3 or SP6 promoter
85
RNA in situ hybridization
Colour substrate nitro blue tetrazolium (NBT)
5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)
Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense
(a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E.
lagascae seedlings were collected 7 days after
sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy
hypocotyl, am apical meristem, ro root
86

• Il livello di RNA presente nella cellula non
  necessariamente riflette direttamente i livelli
  di trascrizione del gene
• Per poter asserire che un gene viene attivato
  TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare
  lattivita

87
Il saggio di run-on (o della catena nascente di
RNA) permette di determinare il livello di
trascrizione di un gene

• Purificare i nuclei
• NTP, 32P GTP
• Trascrizione la catena nascente
• e radioattiva
• Estrazione dellRNA
• Ibridazione a cDNA immobilizzato su filtro

88
Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA
epato-specifici analizzata tramite run-on
Lodish Figure 10-23
89
Northern blotting
90
reverse Northern blotting