Presentazione di PowerPoint

1
Esempi di modelli cinetici
2
Mean open time (MOT) 1/kc Mean closed time
(MCT) 1/ko
Inoltre, allo stato stazionario dPO/dt ko -
(ko kc)Po 0
? Po ko/(ko kc)
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Gating dei canali Simulazioni di 2 Stati
Cinetica lenta ko0.5/ms kc0.5/ms
Cinetica rapida ko5/ms kc5/ms
Significato di ko Per ogni ms che il canale è
nello stato chiuso, esso in media si aprirà 0.5
volte. Significato di kc Per ogni ms che il
canale è nello stato aperto, esso in media si
chiuderà 0.5 volte.
Significato di ko Per ogni ms che il canale è
nello stato chiuso, esso in media si aprirà 5
volte Significato di kc Per ogni ms che il
canale è nello stato aperto, esso in media si
chiuderà 5 volte.
Po0.5
Po0.5
4
Gating dei canali Altre simulazioni a due stati
Alta Po ko5/ms kc0.5/ms
Po0.9
Po0.1
5
Esercizi sul Gating
k
1
Tempo medio di chiusura
Popen stato staz.
o


k

k
k
o
o
c
1
1
Tempo medio di apertura
Costante di tempo dellattivazione



k
k
k
c
o
c



Predizioni
tempo medio di chiusura
tempo medio di apertura
costante di tempo (ms)
Po
esempio
k
(1/ms)
k
(1/ms)
(ms)
(ms)
o
c
1
0.5
0.5
2.0
2.0
0.5
1.0
2
5.0
5.0
3
5.0
0.5
4
0.5
5.0
6
Canale K
Depolarizz.
Livelli energetici
O
C
O
C
1
100
Costanti di velocità
C
O
C
O
100
1
50 mV
Voltaggio
-100 mV
Corrente attraverso singoli canali
Corrente attraverso molti canali
10 ms
7
Gating dei canali Modello a 3 Staticon
inattivazione
2
Si applica a canali V-dipendenti inattivanti
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Gating dei Canali correnti medie con 3 Stati e
inattivazione
ko 0.5/ms kc 0.005/ms ki 0.25/ms k-i
0.025/ms
ki 0/ms k-i 0/ms
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Relazioni tra costanti di velocità e costanti di
tempo in un modello a tre stati con inattivazione
ko
ki
O
I
C
k-i
kc
MOT 1/(kcki) MCT 1/ ko MIT 1/k-i (tempo
medio dello stato inattivato) MOB(kC/ ki)1
(numero medio di aperture/burst)
Regola generale il tempo medio che il canale
trascorre in uno stato è uguale allinverso della
somma delle costanti di velocità che si
allontanano da quello stato
Qualora il flikering sia tra C e O altrimenti,
se fosse tra O e I allora sarebbe MOB(ki/
kC)1
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Diversi gradi di inattivazione
ko 0.5/ms kc 0.005/ms K i 0.25/ms
k -i 0.25/ms
ko 0.5/ms kc 0.005/ms ki 0.25/ms
k -i 0.025/ms
ko 0.5/ms kc 0.005/ms K i 0.25/ms
k-i 0.1/ms
Allaumentare di k-i diminuisce il grado di
inattivazione
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Canale del Na
Depolarizz.
C
Livelli energetici
O
O
I
I
C
2
1000
1000
2000
Costanti di velocità
I
C
O
C
O
I
20000
10
10
20
10 mV
Voltaggio
-100 mV
Corrente attraverso singoli canali
Corrente attraverso molti canali
1 ms
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Che informazioni possono darci registrazioni di
singolo canale circa il gating che già non
abbiamo appreso dallo studio delle correnti
macroscopiche?
Seguirà una reinterpretazione del gating del
canale del Na VD basata su registrazioni di
singolo canale. Aldrich, Corey, Stevens Nature
(1983)
13
Modello classico di inattivazione vs nuove
interpretazioni
A reinterpretation of mammalian sodium channel
gating based on single channel recording Aldrich,
Corey Stevens NATURE (1983)
14
Modello classico di inattivazione vs nuove
interpretazioni
Lanalisi della latenza permette di discriminare
tra i due modelli
l2 ms
l10 ms
15
3
Gating dei canali Modello a 3 Stati
Un semplice schema di blocco
Si applica a bloccanti del canale aperto
canale non bloccato
canale bloccato
C
O
burst
burst
Ricordarsi che la transizione O ? B è data da kB
B, dove B è la concentrazione del
bloccante. u.d.m. kB B (s-1), B (M) ?
kB (M-1s-1)
Mean open time (MOT) 1/(b kB B) Mean
closed time tra i bursts (MCT) 1/a Mean closed
time allinterno dei bursts (MBT) 1/k-B Mean
opening per burst (MOB)(kB B/b)1
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Effetto della concentrazione del bloccante
a b k-B kBB B to 1/tobkBB kB(1/to-b)/B
s-1 s-1 s-1 s-1 mM ms ms-1 M-1s-1
500 1000 100 500 50 0.67 1.49 9.9
250 25 0.81 1.23 9.3
100 10 0.913 1.10 9.5
50 5 0.95 1.05 9.6
- 0 1 1.00 -
17
B50 mM
18
B25 mM
19
B10 mM
20
B5 mM
21
B0
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Un semplice schema di blocco cont.
Sappiamo inoltre che in assenza di bloccante
MOT1/b quindi, possiamo ricavare
kBB. Inoltre, possiamo ricavare la costante
di dissociazione del bloccante KD in quanto
KDk-B/kB (Neher Steinbach, 1978). Pertanto,
in questo semplice schema tutte e quattro le
costanti di velocità e la KD possono essere
determinate dallanalisi dei tempi di chiusura e
di apertura. Un approccio alternativo è il
seguente (Colquhoun Hawkes, 1983) Mean open
time per burst Mo Mr 1/b dove Momean OT,
Mr numero medio di aperture per burst e Mean
closed time per burst Mc Mr CB/b dove CB
B/KD
23
4
Un canale con due stati chiusi distinti
MOT 1/b MC1T 1/(ak-1) MC2T 1/k1 E
Inoltre possibile ricavare che il numero medio
di aperture per burst MOB(a/ k-1)1 il(Colquhoun
Hawkes, 1981) (Johnston Wu, Foundations of
Cellular Neurophysiology p. 268)
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Registrazioni di singolo canale da canali del
Ca2. Configurazione di cell-attached con la
pipetta di patch riempita con Ba2. Il bagno
contiene una soluzione salina normale.
Risposte a depolarizzazioni di circa -5 mV
(sinistra) e 15 mV (destra). Nel pannello di
destra il livello di corrente zero è indicato con
linee orizzontali. Le ampiezze medie di singolo
canale sono 0.9 pA a -5 mV, e 0.6 pA a 15 mV.
Filtro passa-bassi a 1 kHz.
Istogramma dei tempi di chiusura per gli stessi
dati a -5 mV . Listogramma è stato interpolato
con un doppio esponenziale con costanti di tempo
tc 1.05 ms e ts 25.5 ms.. tc rappresenta la
durata media delle brevi chiusure allinterno dei
bursts osservabili nel pannello di sinistra di
(A). ts rappresenta il tempo medio tra eventi
indipendenti. Il numero medio di aperture per
burst è 0.57.
Istogramma dei tempi di apertura per i dati a -5
mV (pannello di sinistra di (A). Listogramma è
stato interpolato con un singolo esponenziale la
cui costante di tempo è to 0.81 ms.
25
Our motivation was to learn more about the
mechanisms by which the Ca channel operates.
Correnti di singolo canale (A), e istogrammi dei
tempi di apertura, chiusura e latenza (B),
calcolati dalle correnti in (A).
Istogramma dei tempi di apertura interpolato con
un singolo esponenziale (costante di tempo di 1.2
msec).
Istogramma dei tempi di chiusura la linea
continua è ottenuta dqallinterpolazione con il
doppio esponenziale A1exp(-t/tc1)
A2exp(-t/tc2). A1/A2 4.5 numero medio di
aperture per burst.
Istogramma delle latenze il picco più alto è a
circa 5-6 ms, suggerendo la presenza di una fase
di attivazione.
26
È prevista cooperatività nellattivazione dei
canali del Na e del K
Entrambi gli schemi predicono lo stesso andamento
temporale dellattivazione (a livello
macroscopico), tuttavia il modello di destra non
è più interpretabile come lapertura di tre gates
m identiche e indipendenti. Piuttosto, esso
potrebbe essere interpretato come unattivazione
con cooperatività positiva in cui ciascuna gate è
più facile da aprire della precedente.
27
5
Un semplice schema di attivazione da agonista
k 1
a
AR
AR
AR
(open)
k -1
b
MOT 1/b Il tempo di chiusura sarà la somma dei
tempi trascorsi negli stati A e AR MCT
1/(ak-1) 1 /(k1A) Questo potrà essere
separato in due componenti di tempi di chiusura
se le costanti di velocità sono
significativamente differenti. Tempo medio in AR
(chiusure dentro i burst) 1/(ak-1) Tempo medio
di chiusura tra i burst) 1/(k1A) MOB a/k-1
1
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• Bibliografia
• Colquhoun Hawkes (1977) Proc R Soc Lond Biol
  199231-262.
• Colquhoun Hawkes (1983) in Single channel
  recording eds. Neher Sakmann, Chapter 9.
• Neher Steinbach (1978) J Physiol 277153-176.

29
FINE