Presentazione di PowerPoint

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La variabilità genetica nei batteri
Le due cellule figlie sono geneticamente
identiche tra loro e alla cellula madre
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La variabilità genetica nei batteri
Nella maggioranza dei casi le mutazioni sono
deleterie..
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La variabilità genetica nei batteri
..ma in qualche caso possono conferire un
vantaggio!
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Le basi molecolari delle mutazioni
Mutazione è un cambiamento ereditario nella
sequenza delle basi nel genoma di un organismo
Mutazioni puntiformi
possono risultare per sostituzione di una base
nel DNA o per inserzione e delezione di una base
(microinserzioni e microdelezioni). Il
cambiamento del fenotipo dipende dal punto esatto
in cui la mutazione è situata nel gene e da quale
prodotto è normalmente codificato dal gene.
Mutazioni che coinvolgono molte paia di basi
Le delezioni possono coinvolgere la perdita di
centinaia o migliaia di paia di basi non
revertono se non per ricombinazione. Le
inserzioni si verificano per aggiunta di nuove
basi al DNA e inattivano il gene in cui accadono.
Molte mutazioni da inserzione sono dovute a
sequenze di DNA specifiche, lunghe 700-1400 bp,
dette sequenze di inserzione. Le mutazioni da
inserzione possono revertere.
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Effetti della sostituzione di una base
mutazione missenso
mutazione nonsenso
mutazione silente
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Scivolamento dello schema di lettura (frameshift)
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Frequenza di mutazione
La frequenza con cui avvengono i diversi tipi di
mutazioni è estremamente variabile. Errori nella
replicazione del DNA ricorrono con una frequenza
di 10-7 10-11 per coppia di basi per singolo
ciclo di replicazione. Per un gene di 1000 basi
la frequenza è dellordine di 10-4 10-8 per
generazione
Retromutazione e Soppressione
Un revertante è un ceppo in cui viene
ripristinato il fenotipo selvatico
Reversione vera (retromutazione) Reversione di
secondo sito (soppressione) mutazione
frameshift mutazione in un secondo
gene Reversione di mutazione nonsenso
Reversione di delezioni e inserzioni
Grosse delezioni possono revertere solo mediante
processi che coinvolgono la ricombinazione
genetica. Alcune inserzioni (elementi
trasponibili) possono revertere per escissione.
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La Mutagenesi
Le mutazioni possono essere
Spontanee
Indotte da mutageni
(frequenza molto bassa)
Mutageni chimici
Mutageni fisici
Analoghi delle basi Agenti alchilanti Agenti
intercalanti
Radiazioni non ionizzantiUV Radiazioni
ionizzanti raggi gamma raggi X raggi
cosmici
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Analoghi delle basi
Simili nella struttuta a purine e pirimidine del
DNA ma difettosi nellappaiamento
Il più delle volte la replicazione avviene
normalmente ma occasionalmente può verificarsi un
errore che verrà fissato come mutazione nel
successivo ciclo di replicazione
T A
BrU A
BrU G
BrU A
C G
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Agenti alchilanti
Nitrosoguanidina, Acido nitroso, Idrossilamina
sono responsabili di reazioni di metilazione,
deaminazione, ecc.
Mutageni molto potenti e inducono mutazioni ad
alta frequenza rispetto agli analoghi delle basi.
Reagendo sul DNA sono in grado di introdurre
cambiamenti anche in assenza di replicazione
Agenti intercalanti
Acridine (arancio di acridina, proflavina) sono
molecole planari che si inseriscono tra due basi
del DNA, separandole
Questa conformazione anormale può portare a
microinserzioni e microdelezioni durante la
replicazione
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Radiazioni non ionizzanti raggi UV
Le basi degli acidi nucleici assorbono
efficientemente la radiazione ultravioletta. Il
picco di assorbimento è a 269 nm
La radiazione UV a 260 nm è lagente letale più
efficiente
Il suo effetto più conosciuto sul DNA è la
formazione di dimeri di pirimidine (due C o T
adiacenti vengono legate covalentemente tra
loro). Induzione del sistema SOS.
La presenza di dimeri aumenta la probabilità che
la DNA polimerasi inserisca in questa posizione
un nucleotide errato.
La radiazione UV è uno strumento molto utile
nellisolamento di mutanti
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Radiazioni ionizzanti
Sono radiazioni a lunghezza donda corta (raggi
X, gamma, raggi cosmici). Più potenti dei raggi
UV e altamente penetranti.
Causano la ionizzazione dellacqua e di altre
sostanze con la produzione di radicali liberi
come lo ione ossidrile (OH-)
La loro azione mutagena è indiretta in quanto il
danno è prodotto dai radicali liberi.
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La variabilità genetica nei batteri
Le mutazioni puntiformi non sono sufficienti a
spiegare la diversità del mondo microbico
Il genoma di un batterio risulta costituito da un
puzzle di sequenze provenienti da altri batteri
che non sono suoi progenitori ma suoi
contemporanei
Indifferenti al mantenimento della loro identità,
i batteri sono capaci di acquisire da altri
organismi geni che permettono loro di diventare
resistenti ad antibiotici causare nuove
malattie aumentare la loro possibilità di
sopravvivenza
Lo scambio di DNA tra i batteri è chiamato
Trasferimento genico orizzontale
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Trasferimento genico orizzontale
Scambio di DNA tra batteri contemporanei
Trasferimento genico verticale
Eredità di un gene dal progenitore
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Significato medico del trasferimento genico
Il trasferimento genico orizzontale tra i batteri
sta avendo effetti immediati e pratici sulla
salute umana
E stato dimostrato il trasferimento di geni
per la resistenza ad antibiotici responsabili
della patogenicità per la degradazione di
inquinanti (biorisanamento)
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geni per la tossina
E. coli (ceppo che causa diarrea)
E. coli O157H7 (causa diarrea emorragica
e danni renali)
Shigella
geni per la resistenza
Ceppo Y sensibile alla penicillina
Ceppo X resistente alla penicillina
Ceppo Y resistente
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Trasduzione
Trasformazione
Coniugazione
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Trasformazione
Processo in cui il DNA presente allesterno del
batterio viene internalizzato nella cellula
ospite, integrato nel cromosoma nella
corrispondente regione omologa e stabilmente
ereditato con le divisioni cellulari
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Lesperimento di Griffith (1928)
Pneumococchi da colonie liscie (S smooth)
Pneumococchi da colonie rugose (R rough)
cellule vive R
cellule vive S
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Lesperimento di Griffith (1928)
Lesame batteriologico rivela batteri vivi di
tipo S
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Trasformazione naturale Batteri Gram
() Streptococcus pneumoniae e S.
sanguis Bacillus subtilis, B. cereus, B.
stearothermophilus Batteri Gram
(-) Neisseria gonorrheae Haemophilus
influenzae, H. parainfluenzae Acinetobacter
calcoaceticus Moraxella oslensis, M.
urethalis Psycrobacter sp. Azotobacter
agilis Pseudomonas stutzeri
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Possibili benefici derivanti dalla trasformazione
Acquisizione di nuove caratteristiche genetiche
Riparo del DNA danneggiato
DNA come fonte di nutrimento
Superamento delle difese dellospite da parte
dei patogeni (N. gonorrhoeae)
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Le fasi del processo di trasformazione naturale
sviluppo della fase di competenza
legame del DNA trasformante alle cellule
competenti
ingresso del DNA trasformante
integrazione del DNA (ricombinazione)
espressione del DNA trasformante
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Sviluppo della fase di competenza
Nella maggioranza dei batteri la competenza è
geneticamente regolata e si manifesta in
condizioni ambientali particolari o in una fase
specifica della crescita della popolazione
Nei batteri Gram negativi ogni individuo di una
popolazione sviluppa la competenza
indipendentemente
Nei batteri Gram positivi lo sviluppo della
competenza è regolato da uno scambio di messaggi
chimici (feromoni) tra le cellule di una
popolazione
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Batteri G negativi
Neisseria gonorrhoeae
La competenza è costitutiva. Quasi tutte le
cellule di una coltura sono competenti e non cè
nessuna relazione con la fase di crescita
Haemophilus influenzae
La competenza è indotta da condizioni che
inibiscono la crescita
Batteri G positivi
Streptococcus pneumoniae
La competenza è controllata da un fattore
extracellulare (ferormone) di 17 aa. Quasi tutte
le cellule di una coltura in fase esponenziale
diventano competenti quando il feromone raggiunge
una concentrazione critica (quorum sensing). Il
100 delle cellule possono diventare competenti
(per pochi minuti!). Il regulone com
Bacillus subtilis
La concentrazione critica di almeno due feromoni
attiva la competenza. Si manifesta in tarda fase
esponenziale o inizio di fase stazionaria. Solo
il 10 dei batteri diventano competenti.
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La trasformazione naturale in Streptococcus
pneumoniae
Il fattore di competenza attiva la produzione di
altre proteine (gt12) che permettono
ladsorbimento del DNA sulla superficie
batterica. I frammenti di DNA sono generalmente
lunghi 15-20 Kb.
Una cellula competente è in grado di legare fino
a 1000 volte più DNA di una cellula non competente
Il DNA a doppia elica viene frammentato in
piccoli frammenti per azione di nucleasi
Unelica del DNA viene degradata da una nucleasi
mentre lelica complementare entra nella cellula
associata a proteine che la proteggono dalla
degradazione
Può entrare DNA di qualsiasi origine ma solo
quello omologo viene integrato e produrre
cambiamenti ereditari nella cellula ricevente
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Batterio Gram positivo
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La trasformazione naturale in Haemophilus
influenzae
Non vengono prodotti fattori di competenza
E trasformabile solo da DNA appartenente a
specie correlate
Il DNA trasformante deve contenere una sequenza
specifica di 11 bp. Questa sequenza è ripetuta
diverse centinaia di volte nel proprio genoma
Il DNA attraversa la membana esterna come doppia
elica in vescicole di membrana
Dallo spazio periplasmico entra nel citoplasma
come singola elica
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DNA trasformante
ingresso
SS-DNA
D-loop
cromosoma
RecA
DNA ligasi
endonucleasi
Pol III exo
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La trasformazione artificiale
La maggior parte dei batteri possono essere
trasformati artificialmente
Vengono utilizzati shock chimici e termici
(CaCl2) o elettrici (elettroporazione)
Il DNA viene introdotto integro nella cellula
DNA lineare a doppia elica
DNA plasmidico
integrazione mediante ricombinazione omologa
replicazione del plasmide
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Lederberg Tatum 1946
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pressione o aspirazione
cotone
ceppo A
ceppo B
La coniugazione richiede un contatto
cellula-cellula quando le colture sono separate
da un filtro poroso permeabile alle macromolecole
ma non ai batteri, la ricombinazione non avviene!
filtro poroso
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Coniugazione
Pili sessuali presenti in numero di 1-10 per
cellula, sono spessi 9-10 nm
34
(No Transcript)
35
(No Transcript)
36
Il Fattore F
37
(No Transcript)
38
(No Transcript)
39
(No Transcript)
40
donatore
ricevente
Viene trasferito un filamento singolo di F
insieme a una copia di parte del cromosoma del
donatore. Nel ricevente viene sintetizzato il
filamento complementare
Una copia del cromosoma con F integrato rimane
nella cellula donatrice dopo la replicazione
della singola elica restante
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Ricombinazione dopo coniugazione con Hfr
esogenote
endogenote
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Modello di Campbell
F
OriT
OriT
a b c d
e
1
b c d e
a
2
c d e a
b
3
43
(No Transcript)
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Gradiente di trasferimento
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Il fattore F e la F-duzione
Si ottiene in seguito a un errato processo di
escissione di F
La formazione di un F produce una delezione nel
cromosoma
In seguito ad incrocio F x F- si
produce un diploide parziale o merizigote
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Ricapitolando
Il fattore F può trovarsi nella cellula
come 1. F 2. Hfr 3. F
da un incrocio
i riceventi
F x F-
diventano F
rimangono F- ma possono acquisire nuovi caratteri
Hfr x F-
diventano F e diploidi parziali per uno o più
geni
F x F-
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Coniugazione in altri batteri Gram negativi
Salmonella Sono stati isolati diversi plasmidi
coniugativi in ceppi naturali di Salmonella sp.,
ma per gli studi di genetica viene utilizzato lF
di Escherichia coli
Pseudomonas Molti plasmidi coniugativi e
mobilizzabili sono stati descritti e molto
studiati in ceppi di Pseudomonas. Il plasmide
FP2 di P. aeruginosa può mobilizzare anche il
cromosoma mobilizzazione unidirezionale a
partire da un solo sito cromosomale
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Coniugazione in altri batteri Gram positivi

• Mediante plasmidi coniugativi simili al fattore F
• (Streptomyces)
• Mediata da FEROMONI (Streptococcus) responsabili
  di aggregazione cellulare
• Coniugazione traspositiva (Bacillus,
  Staphilococcus,
• Streptococcus)

In Streptomyces coelicolor il plasmide SCP1
interagisce con il cromosoma batterico in diversi
siti. Due differenze con F trasferimento
bidirezionale tutti i ricombinanti ottenuti sono
fertili
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I plasmidi
Elementi genetici circolari, extracromosomali,
capaci di replicazione autonoma (replicone)
Le dimensioni variano da 1 Kb a gt1000 Kb e il
loro numero varia da 1 a diverse centinaia di
copie per cellula ospite
La loro informazione genetica non è essenziale
per la cellula ospite ma può conferire un
vantaggio selettivo in particolari condizioni
Alcuni plasmidi possono esistere sia allo stato
libero sia integrato nel cromosoma dellospite
(episomi)
Alcuni plasmidi si mantengono stabilmente
allinterno della cellula, altri hanno la
capacità di diffondersi attraverso la coniugazione
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(No Transcript)
51
(No Transcript)
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Plasmidi R
Codificano per enzimi capaci di distruggere o
modificare gli antibiotici come ampicillina,
cloramfenicolo, tetraciclina, kanamicina ecc.
Alcuni plasmidi portano ununica resistenza,
altri fino a otto. Possono essere anche
coniugativi e diffondersi rapidamente.
Plasmidi col
Conferiscono un vantaggio al batterio portatore
nei confronti di batteri della stessa specie o
specie affini. Codificano per le batteriocine
(colicine, subtilisine, ecc.) capaci di
permeabilizzare le membrane o degradare gli acidi
nucleici.
Plasmidi di virulenza
Portatori di tossine rendono il ceppo batterico
più patogeno. Il ceppo di E. coli responsabile
della diarrea del viaggiatore è portatore di un
plasmide codificante per una enterotossina.
Plasmidi metabolici
Codificano per enzimi capaci di degradare
composti aromatici, pesticidi, zuccheri ecc. In
alcuni ceppi di Rhizobium portano i geni
necessari per la nodulazione nelle leguminose.
B237 P302
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Plasmidi di virulenza e malattie
Molti batteri risultano patogeni a causa dei loro
plasmidi
Il plasmide porta geni per le tossine
rende il batterio più capace di
infettare lospite
rende il batterio più
resistente alle difese dellospite
Altri batteri patogeni portano plasmidi di
virulenza
Tossina tetanica di Clostridium
tetani Antratossina di Bacillus anthracis
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Incompatibilità fra plasmidi
Lincompatibilità si osserva quando un plasmide
entra in una cellula dove è già presente un
plasmide simile.
Il nuovo plasmide non può essere mantenuto e
viene perso nei successivi cicli di divisione
batterica.
Il fenomeno è controllato dai geni coinvolti
nella regolazione della replicazione plasmidica
Plasmidi che condividono lo stesso sistema di
replicazione appartengono allo stesso gruppo di
incompatibilità (Inc) e sono tra loro
incompatibili
Perchè un batterio possa contenere diversi tipi
di plasmidi, questi non devono essere
strettamente correlati
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Sistema host cell killing del plasmide R1
Il sistema hok/sok di alcuni plasmidi a basso
numero di copie assicura il mantenimento del
plasmide allinterno di una popolazione batterica
hoc mRNA emivita 20 min
SD
hok
128 bp
sok
sok mRNA emivita lt 1-2 min
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Il sistema veleno-antidoto del plasmide F
ccdA
ccdB
72 AA
101 AA
veleno (proteina stabile) interagisce con la DNA
girasi
antidoto (facilmente degradabile) blocca
lattività di CcdB
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Trasduzione
Modalità si scambio genetico fra batteri mediato
da un virus
Trasduzione generalizzata
Trasduzione specializzata
Qualsiasi marcatore genetico può essere
trasferito da un donatore a un ricevente
Solo marcatori specifici possono essere
trasferiti
P22, P1 per Gram(-)
l per E. coli
PBS1 per Gram ()
SPb per B. subtilis
Anche se non tutti i fagi trasducono e non tutti
i batteri possono essere trasdotti, il fenomeno è
sufficientemente diffuso da far supporre che
svolga un ruolo importante nel trasferimento
genico in natura
B232
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Lederberg e Zinder 1951
S.typhimurium infettato da P22
filtro poroso
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testa
collare
coda
guaina elicoidale
piastra basale
fibre caudali
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Batteriofagi virulenti
ciclo litico
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Batteriofagi temperati
ciclo litico
ciclo lisogenico
profago
induzione
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Il processo di infezione virale
DNA batterico
DNA virale
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Trasduzione generalizzata
I fagi capaci di dare trasduzione generalizzata
devono possedere un meccanismo di
impacchettamento del DNA che permetta il
riconoscimento accidentale del DNA dellospite
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Il fago trasducente (1/103 della popolazione
virale) può infettare un altro batterio ma non
iniziare un normale ciclo di infezione in quanto
il DNA virale è assente (particella difettiva)
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fago trasducente
La quantità di DNA batterico trasportata dipende
dalle dimensioni del capside. Il fago P1 di E.
coli trasporta 99 Kb (2 del cromosoma batterico)
Nuovi alleli, o anche nuovi geni, possono essere
integrati nel cromosoma ospite. Dal 70 al 90 del
DNA trasdotto non viene integrato, ma può
esprimersi per un numero limitato di generazioni,
dando dei diploidi parziali (trasduzione abortiva)
a
x
x
a-
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Trasduzione specializzata
attP
attB
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Lisato a bassa frequenza di trasduzione (lisato
LFT)
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Trasduzione per ricombinazione
Le particelle trasducenti difettive possono aver
perso alcuni geni essenziali per la propria
riproduzione
Hanno un sito di integrazione ibrido, non
funzionale
Trasduttanti stabili possono derivare dalla
ricombinazione tra il cromosoma del fago e quello
del batterio in seguito a due crossing-over su
entrambi i lati del sito gal
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Trasduzione in un batterio lisogeno
I fagi ldgal possono integrarsi in un batterio
lisogeno in quanto il sito att ibrido è identico
a quelli generati dal profago
Il fago normale fornisce anche i geni persi dal
fago difettivo e viene chiamato fago helper,
perché aiuta il fago difettivo a integrarsi e
riprodursi
I trasduttanti sono instabili perché il profago
può essere indotto allescissione
Lisato ad alta frequenza di trasduzione (lisato
HFT)
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Caratteristiche comuni ai tre meccanismi di
trasferimento genico
1. Solo una porzione del cromosoma è
trasferita 2. Il trasferimento è sempre
polarizzato DONATORE RICEVENTE 3. Il
prodotto del trasferimento non è un vero zigote
per questo viene chiamato MERIZIGOTE 4. Il DNA
trasferito (ESOGENOTE) può essere trasmesso alla
progenie solo se viene incorporato nel genoma
della cellula ricevente (ENDOGENOTE) CASO
PARTICOLARE trasferimento di un replicone
(PLASMIDE) I processi di trasferimento genico
hanno un ruolo importante nella variabilità
genetica delle popolazioni batteriche in quanto
assicurano la diffusione di materiale genetico e
quindi lacquisizione di nuovi caratteri