NUCL

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NUCLÉOLO
Profa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo
Oliveira Pós Graduanda Priscila Pasqüetto Mendonça
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NUCLÉOLO

• Estrutura facilmente visível (sem qualquer
  coloração) ? índice de refração
• - Descrito por Fontana (1781) e denominado por
  Valentin (1839)

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• Organela celular, cuja função é a de produzir
  ribossomos
• Geralmente ovalada
• Ausência de membrana ao redor (sem barreira de
  difusão)

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Tamanho, forma e número depende do estado
funcional da célula

• - Tamanho - Grandes glândulas e neurônios
• - Pequenos céls da glia e endotélio
• Número - Normalmente 1 (linfócitos humanos)
• - 1 hepatócitos, céls vegetais (tulipas
  6-13)
• - Ovócitos de anfíbios 3000

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Composição Química

• RNA 3-17 (pp RNAr) (RNP)
• DNAr até 17 (seqüências altamente repetidas)
• Proteínas até 85 - histonas
• - acídicas Numatrina, Nucleolina,
  Ribogranulina
• - enzimas RNA polimerase I, DNA
  topoisomerase I e II

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Métodos de Estudo

• Microscopia de Luz
• Métodos citoquímicos de basofilia (AgNOR, Azul
  de Toluidina e Variante da Concentração
  Eletrolítica Crítica)

Cromatina esverdeada
Nucléolo - azul
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Métodos de Estudo

• Microscopia de Luz
• Acridina Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado)
• Microscopia de contraste de fase

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Métodos de Estudo
Impregnação por íons prata no cito diagnóstico do
câncer
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Nucléolo x Citodiagnóstico

• Parâmetros
• Tamanho
• Número
• Forma
• Razão área N
• nu

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Métodos de Estudo
Microscopia Eletrônica - Método de Bernhard ?
RNA proteínas elétrondensos ? DNA
eletronlúcidos
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Métodos de Estudo

• Além de...
• Análises bioquímicas e microespectrofotometria
• - Autorradiografia
• - Agentes inibidores do RNAr
• Análises moleculares

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Experimento realizado na região espaçadora ITS-1

• Estudaram as regiões espaçadoras ITS-1 da Região
  Organizadora Nucleolar (RON)
• Migração das moléculas de RNAr

Figura 1. (A) e (B) Polimorfismo de tamanho para
a região ITS-1 do DNAr de triatomíneos.Os valores
aproximados em pares de base são Ph 600 pb, Pm
800 pb, Tb 850 pb, Ti 750 pb e Tv 1000 pb, Rd e
Rn 300 pb, Rr 250 pb. Letra L designa os
marcadores de tamanho molecular (1Kb Ladder,
Gibco).
Tartarotti,E Ceron, C. R, 2002
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Morfologia do Nucléolo
No microscópio de luz simples - ovalada, no
máximo alguns vacúolos No microscópio
eletrônico três grandes regiões
Centro Fibrilar (CF)
Componente Fibrilar Denso (CFD)
Componente Granular (CG)
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Morfologia do Nucléolo (MET)

• Centro Fibrilar (CF)
• Conjunto de finas fibrilas (4-8nm)
• ? atividade transcricional, ? n e tamanho dos CFs

• Composição Química DNAr, DNA topoisomerase I,
  RNA polimerase I, RNP, Nucleolina, Numatrina,
  Fibrilarina

Centro Fibrilar (CF)
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Morfologia do Nucléolo (MET)

• 2) Componente Fibrilar Denso (CFD)
• Fibrilas densamente empacotadas ? redes
• Ao redor dos CFs
• Composição Química DNAr , RNA polimerase I,
  Fibrilarina, Nucleolina, Numatrina

Componente Fibrilar Denso (CFD)
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Morfologia do Nucléolo (MET)

• 3) Componente Granular (CG)
• Estruturas granulares de 10 a 15nm de diâmetro
• Periferia, ao redor do CFD
• Local de armazenamento das pré unidades
  ribossômicas
• Composição Química RNP, Fibrilarina, Nucleolina,
  Ribogranulina

Componente Granular (CG)
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Morfologia do Nucléolo
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Morfologia do Nucléolo (MET)
Vários Centros Fibrilares
Alta transcrição
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Morfologia do Nucléolo (MET)

• 4) Esqueleto Nucleolar
• Região amorfa relacionada com o esqueleto nuclear
• Composição Química Proteínas acídicas
• 5) Vacúolos Nucleolares
• Áreas vazias????
• Dúvidas... Artefatos??? ... Áreas menos densas???

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Morfologia do Nucléolo (MET)

• 6) Cromatina associada ao Nucléolo
• Ao redor envia ramificações intranucleolares
• Cromatina perinucleolar não faz parte do
  nucléolo
• Segmentos cromossômicos específicos - RONs

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Tipos de Nucléolo

• a) Nucléolos Reticulados (nucleolonemas)
• Região granular periférica Região fibrilar
  central
• b) Compactos
• - Essencialmente granulosos (massa celular
  compacta e anastomosada)
• c) Em anel
• Camadas concêntricas
• - central filamentosa
• - cortical granulosa

EX Triatoma infestans
EX Allium cepa
EX Anfíbios
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Fisiologia do Nucléolo
- Biogênese dos RIBOSSOMOS - Função bem
estabelecida com observações de Brown em 1964
(Xenopus laevis) - Defeito cromossômico formação
dos nucléolos (perda de DNAr) - Número de
nucléolos 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa) Aa X
Aa ¼ AA ½ Aa ¼ aa
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Experimento de Miller e Beatty (1967)

• Ovócitos de Triturus viridescens
• Choque osmótico separação das regiões
  nucleolares
• CF filamento axial de DNA recoberto, a
  intervalos regulares, por RNA 45S transcrito
• CG moléculas de RNA precursor da grande
  subunidade 32S

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Experimento de Miller e Beatty (1967)
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Experimento de Miller e Beatty (1967)

• DNAr em tandem
• Muitas moléculas de RNAr transcritas
• Regiões de DNA espaçador
• Árvore de Natal

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Experimento de Miller e Beatty (1967)
- Cada RNA polimerase se associa ao promotor , e
se move ao longo do DNAr
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Metabolismo Nucleolar
RON motivo genético altamente redundante DNA
Espaçador ITS Segmentos intercalares
transcritos ETS Seqüência externa transcrita
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Metabolismo Nucleolar
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Metabolismo Nucleolar
Subunidade maior (60S) RNAr 28S RNAr 5,8S
RNAr 5S proteínas nucleolares
Subunidade menor (40S) RNAr 18S proteínas
nucleolares
Proteínas nuleolares Importadas do citoplasma
S Unidade de Sweedberg é a unidade que se
utiliza na medida da velocidade com a qual se
sedimentam as partículas no campo de
centrifugação. Ocorre influência do tamanho,
densidade e forma da partícula e também do meio
no qual as partículas estão suspensas.
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Metabolismo Nucleolar
Processamento do RNA
RNA 45 S
RNA 32 S RNA 20 S
RNA 28 S RNA 18 S

RNA 5,8 S
Subunidade menor
Subunidade maior
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Metabolismo Nucleolar
As proteínas nucleolares (ou ribossomais) são
importadas para o nucléolo a partir do citoplasma
e começam a unir-se ao pré-RNAr (RNA 45 S) antes
de sua clivagem. Enquanto o pré-RNAr é
processado, proteínas nucleolares adicionais e o
RNAr 5 S (transcrito de uma outra região que não
pertence à RON) unem-se para formar partículas
pré-ribossomais. Os passos finais da maturação
seguem a exportação de partículas pré-ribossomais
para o citoplasma, produzindo as subunidades
ribossomais 40 S e 60 S
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Regiões Organizadoras Nucleolares (RONs)

• Moldes de DNA relacionados com a síntese de
  estruturas nucleolares zonas de constricções
  secundárias que apresentam regiões satélites
• RONs local do cromossomo responsável pela
  codificação do RNA 45S

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Cromossomos Humanos
- zonas de constricções secundárias (ativamente
transcritos) - regiões satélites
Representação esquemática da metade do cariótipo
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Biogênese do Nucléolo

• Como o nucléolo se organiza??!!
• Presente durante intérfase e início da prófase
• Desaparece final da prófase (mitose) e no
  diplóteno (meiose)
• Reaparece na telófase

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Biogênese do Nucléolo
No Homem após a mitose, dez pequenos nucléolos
são formados, que rapidamente se fundem, formando
um único e grande nucléolo
A aparência do nucléolo muda dramaticamente
durante as diferentes fases do ciclo celular
Dez pontinhos, representando os dez cromossomos
portadores das RONs
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Biogênese do Nucléolo
Três hipóteses

• Reconstrução do nucléolo a partir dos corpúsculos
  pré-nucleolares que estão agrupados junto as RONs
• 2) Reconstrução a partir de uma Matriz
  pré-existente
• 3) Formação de estrutura totalmente nova a partir
  da RON

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OBRIGADA!