Comment les cellules lisent le g

1
Comment les cellules lisent le génome de l'ADN
à la protéine
2
Les ribosomes
3
Les ribosomes

• Machine catalytique
• Plusieurs millions dans le cytoplasme
• Composition
• plus de 50 protéines les protéines ribosomales
• 4 molécules d'ARN
• Assemblés dans le nucléole
• Deux sous-unités
• une grosse
• une petite

4
Le ribosome

• Petite sous-unité
• ARNt
• Appariement
• Grosse sous-unité
• Liaison peptidique
• Se lient puis se séparent
• Eucaryote 2 AA par seconde et par ribosome
• Procaryote 20 AA par seconde et par ribosome

5
Fig 6-62

• Ribosomes dans le cytoplasme d'une cellule
  eucaryote

6
Fig 6-63-1

• Ribosome procaryote

7
Fig 6-63-2

• Ribosome eucaryote

8
Sites de liaison de l'ARN dans le ribosome

• ARNt (3 sites)
• Site A Aminoacyl-tRNA
• Site P Peptidyl-tRNA
• Site E Exit
• ARNm (1 site)
• 2 sites seulement sont occupés à la fois

9
Fig 6-64-1 Sites de liaison du ribosome

• Ribosome bactérien
• protéines et ARN

Site A Site P Site E
10
Fig 6-64-2 Sites de liaison du ribosome

• Ribosome bactérien protéines et ARN
• Petite sous-unité Grosse sous unité

(C) et (D) ont la même orientation
11
Yusupov,MM2001fig2
12
Yusupov,MM2001fig2
13
Yusupov,MM2001fig3a
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Yusupov,MM2001fig3b
15
Yusupov,MM2001fig3cd
16
Yusupov,MM2001fig4
Conformational differences between rRNAs in 70S
ribosomes and 30S and 50S subunits
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Yusupov,MM2001fig5ac
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Yusupov,MM2001fig5d
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Yusupov,MM2001fig5e
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Yusupov,MM2001fig6a
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Yusupov,MM2001fig6b
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Yusupov,MM2001fig6cde
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Yusupov,MM2001fig7abc
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Yusupov,MM2001fig7de
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Yusupov,MM2001fig8a
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Yusupov,MM2001fig8b
27
Comment les cellules lisent le génome de l'ADN
à la protéine

1. De l'ADN à l'ARN
2. De l'ARN à la protéine
3. Le monde de l'ARN et les origines de la vie

28
Comment les cellules lisent le génome de l'ADN
à la protéine

1. De l'ADN à l'ARN
2. De l'ARN à la protéine
3. Le monde de l'ARN et les origines de la vie

29
I - De l'ADN à l'ARN
30
Synthèse des ARN non codant (ribosomaux)

• ARN quelques du poids sec de la cellule
• ARNm 3-5 des ARN totaux
• ARNr 80 des ARN de la cellule

31
ARN ribosomaux

• Polymérase (chez les procaryotes)
• Polymérase I (chez les eucaryotes)
• très proche de pol II
• pas de queue C terminale (à la pol I) ?
• pas de chapeau 5' (au transcrit)
• pas de queue polyA (au transcrit)

32
Amplification de la production des gènes

• ARNm
• gène unique (en général)
• amplification à la traduction des protéines
  produites
• ARNr
• produit final ?
• pas d'amplification à la traduction mais
• gènes en copies multiples ( "ADN ribosomal")

33
Besoins en ARNr

• 10 millions de copies de chaque type d'ARNr pour
  construire 10 millions de ribosomes
• E Coli 7 copies de ses gènes à ARN
• Cellules humaines
• 200 copies par génome haploïde
• dispersés sur 5 chromosomes (13,14,15,21,22)
• ARN 5S localisé sur le chromosome 1
• Xenopus
• 600 copies par génome haploïde
• un seul groupe sur un seul chromosome

34
Fig 4-11 Caryotype (schéma)
Cellules humaines
Tige des satellites des 13,14,15,21,22
35
Fig 6-41 ME transcription de gènes en tandem
Xenopus microscopie électronique
transcription de gènes en tandem
36
Fig 6-9 ME transcription de gènes en tandem FG
Xenopus microscopie électronique
transcription de gènes en tandem
1 micron
37
Les ARNr

• 4 types (18S, 28S, 5,8S, 5S)
• une copie par ribosome
• 18S, 28S, 5,8S gros précurseur modifié de 45S
• 5S
• Chromosome 1 (chez lhomme)
• groupe de gènes séparés
• ARN polymérase III
• pas de modifications chimiques
• pourquoi ?

38
Fig 6-42

• Modifications chimiques et maturation du 45S

39
Fig 6-43A
100 méthylations 100 isomérisations

• Deux modifications du 45S par des ARN guide

40
Les ARN "guide"

• Les modifications chimiques du précurseur 45S
• aident au repliement
• et à l'assemblage de l'ARN dans le ribosome
• se font à des positions spécifiques du précurseur
• grâce à
• des ARN "guides"

41
Fig 6-43B

• snoRNP
• ARN
• Protéines

42
Les snoARN(small nucleolar ARNs)

• comprennent les ARN guides
• Participent à la formation du nucléole
• souvent codés dans les introns d'autres gènes
• donc synthétisés par la pol II

43
Kiss,T2001(fig1)
Structure et fonction de snoARN guide

• Fig. 1. Structure and function of (A)
  2'-O-methylation and (B) pseudouridylation guide
  snoRNAs. The consensus sequences of boxes C, C',
  D, D', H and ACA are indicated (R is a purine and
  N stands for any nucleotide). Models for
  molecular selection of 2'-O-methylated
  nucleotides and pseudouridine were adopted frfrom
  Kiss-Lââszlô ô et al. (1998) and Ganot et al.
  (1997a), respectively.

(A) snoARN guide2'-O-methylé
(B) snoRNA guide pseudouridylé
44
Kiss,T2002

• Figure 1. Structure and Function of Box C/D and
  Box H/ACA snoRNAs
• In 2'-O-methylation guide snoRNAs, the box C and
  D motifs and a short 5', 3'-terminal stem
  constitute a kink-turn (K-turn) structural motif
  that is specifically recognized by the "15.5 kDa
  snoRNP protein. The C' and D' boxes represent
  internal, frequently imperfect copies of the C
  and D boxes. Dashed lines indicate nucleotides
  interacting in the C and D boxes (Watkins et al.,
  2000 Klein et al., 2001).
• The pseudouridylation guide snoRNAs fold into a
  hairpin-hinge-hairpin-tail structure and
  contain the H and ACA boxes. The box C/D
  2'-O-methylation guide snoRNAs and the substrate
  RNAs form a 1021 base pair double helix in which
  the target residue is positioned exactly five
  nucleotides upstream of the D or D' box. The 5'
  and/or 3' hairpin of the box H/ACA
  pseudouridylation guide snoRNAs contains an
  internal loop, called the pseudouridylation
  pocket, that forms two short (310 bp) duplexes
  with nucleotides flanking the unpaired substrate
  uridine that is located about 15 nucleotides from
  the H or ACA box of the snoRNA. Although each box
  C/D and H/ACA snoRNA could potentially direct two
  modification reactions, apart from a few
  exceptions, the majority of snoRNAs possess only
  one functional 2'-O-methylation or
  pseudouridylation domain. The snoRNA core motifs
  that are essential and sufficient for the correct
  processing and nucleolar accumulation of snoRNAs
  are highlighted in red. Regions that do not
  contribute to the metabolic stability of snoRNAs
  are blue. SnoRNAs transcribed independently by
  RNA pol II contain 5' leader sequences and carry
  the trimethylguanosine cap structure (m3Gppp).
  Substrate RNAs are green. Nucleotides destined
  for pseudouridylation ('IN) and 2'-O-methylation
  (circled m) are marked.

45
Kiss,T2001(fig2)
Biogenesis and function of 2'-O-methylation and
pseudouridylation guide snoRNAs

• Fig. 2. Biogenesis and function of
  2'-O-methylation and pseudouridylation guide
  snoRNAs. In mammalian cells, all guide RNAs are
  synthesized within introns of pre-mRNAs in the
  nucleoplasm. Most intronic snoRNAs are processed
  frfrom the removed and debranched host intron by
  exonucleolytic activities. It remains unclear
  whether 5' and 3' end processing of snoRNAs
  occurs already in the nucleoplasm, or later in
  the nucleolus. Guide snoRNAs accumulating in the
  nucleolus direct 2'-O-methylation and
  pseudouridylation of the 18S, 5.8S and 28S rRNAs,
  the U6 snRNA and perhaps other cellular RNAs,
  including tRNAs, the signal recognition particle
  (SRP) and telomerase RNAs. It seems that box C/D,
  but not box H/ACA snoRNAs, transiently appear in
  the Cajal body before accumulating in the
  nucleolus. Some guide RNAs (scaRNAs) directing
  modification of the pol II-transcribed
  spliceosomal snRNAs accumulate in the Cajal body
  (CB). For other details, see the text.

46
Le nucléole

• Bien visible en microscopie optique dans le noyau
  des eucaryotes

47
Nucléole en microscopie optique
48
Nucléole en microscopie optique
49
Nucléole en microscopie optique
50
Nucléole en microscopie optique
51
Nucléole en microscopie optique
52
Nucléole en microscopie électrinique
53
Le nucléole

• Site de synthèse et de maturation des ARNr
• Assemblage des ARNr en ribosomes
• Pas de membrane
• Contient
• gènes d'ARNr
• précurseurs d'ARNr
• ARNr matures
• enzymes de la maturation des ARNr
• snoRNPs
• protéines ribosomales

54
Le nucléole

• 700 références en 1898
• Évolution à partir d'une ancienne structure
• Taille fonction du nombre de ribosomes que la
  cellule produit
• 3 composants
• centre fibrillaire
• composant fibrillaire dense
• composant granulaire
• Transcription entre centre fibrillaire et
  composant fibrillaire dense
• Maturation et assemblage du centre vers la
  périphérie

55
Fig 6-44 ME

• Nucléole de fibroblaste humain en microscopie
  électronique mise en place dans le noyau

56
Fig 6-44-2 ME FG du nucléole

• Nucléole de fibroblaste humain en microscopie
  électronique les trois composants

57
Le nucléole

• Les gènes d'ARN ribosomal sont répartis en 10
  groupes sur les chromosomes acrocentriques

58
Fig 4-11 Caryotype (schéma)
Cellules humaines
Tige des satellites des 13,14,15,21,22
59
Fig 6-45

• Modifications morphologiques du nucléole au cours
  du cycle cellulaire

60
Fig 6-46

• Fusion nucléolaire dans des fibroblastes humains
  en culture

61
Fig 6-47

• Fonction du nucléole dans la synthèse des
  ribosomes et quelques autres ribonucléo-protéines

62
Autres fonctions du nucléole

• Maturation de U6snRNP (une molécule d'ARN7
  protéines)
• Assemblage de télomérase
• Assemblage de SRP
• Maturation de ARN de transfert
• Grosse usine de ribonucléoprotéines de toutes
  sortes avec des ARN non codant

63
Autres structures intra-nucléaires

• Corps de Cajal (1906)
• Gemini of Coiled bodies (GEMS)
• Granules interchromatiniens ( speckles)

64
Autres structures intra-nucléaire

• Pas de membrane
• Très dynamique
• Résultent de l'association de protéines et d'ARN
  (et d'ADN ?) impliquée dans la synthèse,
  assemblage, stockage de macromolécules impliquées
  dans l'expression des gènes

65
Corps de Cajal et GEMS (Gemini of Coiled bodies)

• Se ressemblent
• Marchent par deux dans le noyau
• Structures distinctes ?
• Site de maturation finale et d'assemblage des
  snARN et snoARN ?
• Les snRNP sont assemblées au début dans le
  cytosol mais elles sont transportées dans le
  noyau pour leur maturation finale
• Lieu de recyclage des snRNP ?

66
Fig 6-48 A-D Nuclears bodies

• Noyau de cellule humaine
• Fibrillarine composant de plusieurs snoRNP ?
  présent dans les nucléoles et les corps de Cajal
• ? Corps de Cajal

Fibrillarine (snoRNP) nucléole et corps de Cajal
Speckles
Chromatine
Coiline (Cajal)
67
Fig 6-48 E Nuclears bodies

• Noyau de cellule humaine
• superposition des 4 images précédentes

68
Granules interchromatiniens

• Stocks de snRNP matures prêtes à être utilisées
  pour l'épissage des pré-ARN

69
Fig6-49

• Structures sub-nucléaires

• Corps de Cajal et GEMS sites de modifications
  finales des snRNP et snoRNP
• Granules interchromatiniens lieux de stockage

70
Cycle des snARN

• Synthèse initiale
• Exportation hors du noyau
• Maturation en 5' et 3'
• Assemblage avec les protéines des snRNP
  (protéines Sm)
• Réimportation dans le noyau
• Modifications finales dans les corps de Cajal
• Éventuellement (eg U6 snRNP) modification par les
  snoARN dans le nucléole
• Les sites de transcription active et d'épissage
  correspondent aux "fibres périchromatiniennes" de
  la microscopie électronique

71
Lewis,JD2000(fig1) Science

• Like Attracts Like Getting RNA Processing
  Together in the Nucleus Joe D. Lewis and David
  Tollervey DAPI (blue), anti-SF2 (red),
  transcription (green)
• Fig 1. SF2 is concentrated at a subset of sites
  of active transcription.
• (A) The anti-SF2 monoclonal antibody (90) is
  specific for a single member (variously
  designated as SRp30a, ASF, or SF2) of the family
  of SR proteins recognized by anti-SR.
• (B) In immunostaining, anti-SF2 decorates many
  particles distributed throughout the nucleoplasm
  (red channel). The green channel shows sites of
  bromouridine 59-triphosphate (BrUTP)
  incorporation. Arrowheads indicate prominent
  points of red and green coincidence, indicating
  that SF2 is concentrated at these sites of active
  transcription. A single optical section of a HeLa
  cell nucleus is shown, following deconvolution.
  Figure generously provided by K. Neugebauer

72
Lewis,JD2000(fig2) Science
RNA processing in the nucleolus

• Like Attracts Like Getting RNA Processing
  Together in the Nucleus
• Joe D. Lewis and David Tollervey
• Fig. 2. RNA processing in the nucleolus. Within
  the nucleolus the pre-rRNAs are processed to the
  mature rRNAs by endonuclease cleavage and
  exonuclease digestion see (32). During this
  processing, the rRNAs assemble with the
  approximately 80 ribosomal proteins and undergo
  extensive covalent nucleotide modification. The
  box C 1 D class of snoRNAs select sites of
  29-O-methylation (91, 92) and associate with
  three common proteins including
  Nop1p/fibrillarin, the putative rRNA
  29-O-methylase (93). The box H 1 ACA class of
  snoRNAs select sites of pseudouridine (C)
  formation (94, 95) and associate with four common
  proteins including Cbf5p/dyskerin/NAP57 the
  probable C-synthase (96 98). The snoRNAs not
  only carry the modifying enzymes to the pre-rRNA
  but, by specific base-pairing, create the enzyme
  recognition site. A small number of snoRNAs of
  each class, including the U3 snoRNA, are required
  for processing of the pre-rRNA, probably
  functioning in the structural reorganization of
  the pre- RNA. C formation and 29-O-methylation of
  the U6 snRNA is also nucleolar, and methylation
  is directed by box C 1 D snoRNAs (99, 100).
  Moreover, there are orphan snoRNAs that are
  predicted to select sites of RNA modification but
  for which no known target exits (101), suggesting
  that other RNA species, possibly including mRNAs,
  are modified in the nucleolus and/or CBs (see
  Fig. 3). The RNA component of human telomerase is
  targeted to the nucleolus by a 39 domain that
  closely resembles the box H1ACA class of snoRNAs
  (102, 103). Like other H1ACA snoRNAs, human
  telomerase RNA is associated with dyskerin,
  mutations in which are associated with the
  hereditary disease dyskeratosis congenita and
  with reduced telomerase activity (102, 104). In
  contrast, the yeast telomerase RNA associates
  with the Sm-proteins characteristic of the
  spliceosomal snRNAs (105). Initial assembly of
  another RNA-protein complex, signal recognition
  particle (SRP) may also occur in the nucleolus.
  The SRP RNA and three of the six SRP proteins,
  SRP19, SRP68, and SRP72, are detected in the
  nucleolus, but not the later assembling SRP54
  protein (106, 107). Another major class of RNA,
  pre-tRNAs, are localized to the yeast nucleolus,
  together with the pre-tRNAprocessing enzyme
  RNase P (108). Human RNase P was similarly found
  to be localized in the nucleolus and also in
  coiled bodies (109), indicating that pre-tRNA
  processing is a conserved nucleolar function.

73
Lewis,JD2000(fig3) Science
Coiled (Cajal) bodies and their Gems

• Like Attracts Like Getting RNA Processing
  Together in the Nucleus
• Joe D. Lewis and David Tollervey
• Fig. 3. Coiled (Cajal) bodies and their Gems. In
  vertebrates, the newly synthesized snRNAs are
  exported to the cytoplasm where they assemble
  with the seven common Sm proteins and undergo 39
  processing and cap- rimethylation to form core
  snRNPs that are reimported into the nucleus.
  Microinjected snRNAs (110, 111) and transiently
  expressed Sm proteins (59) are observed in CBs
  before their appearance in other nucleoplasmic
  regions. In contrast, mature snRNPs do not
  initially localize to CBs on nuclear reentry
  after mitosis, suggesting that late snRNP
  maturation and assembly steps take place in the
  CBs for example, covalent modification of the
  snRNAs by C formation and 29-O-methylation and
  association with the large numbers of
  species-specific snRNP proteins. In the
  cytoplasm, the Sm proteins are associated with
  the SMN complex, which includes oligomers of the
  SMN protein (survival of motor neurons), together
  with Gemin2, Gemin4, and a putative DEAD-box RNA
  helicase, Gemin3 (112116). Each of these
  proteins also concentrates in nuclear structures
  called Gems (Gemini of coiled bodies) (117). In
  many cell types, Gems show partial or complete
  coincidence with CBs (118), and their functional
  distinction is unclear. This suggests that newly
  synthesized snRNPs are escorted to the nucleus by
  the SMN complex. This complex may also function
  in recycling snRNPs following splicing (119).
  Yeast lacks both morphological CBs and an obvious
  coilin homolog, but does have a Gemin2 homolog,
  Brr1p. Like Gemin2, Brr1p interacts with Sm
  proteins and brr1 mutations inhibit snRNA 39
  processing, suggesting that this pathway is
  conserved (113, 120). CBs and SMN are also
  implicated in snoRNP synthesis. Microinjected box
  C 1 D snoRNAs localize transiently to CBs before
  appearing in the nucleoli (103, 111), and mutant
  snoRNAs that lack an intact box C 1 D region (the
  likely protein-binding sites) are retained in the
  CBs (111). In contrast, the H 1 ACA snoRNAs, and
  the associated Nopp140p protein, accumulate first
  in nucleoli and then in CBs (121). Multiple
  interactions between snoRNAassociated proteins,
  coilin, and SMN have been observed (117, 121,
  122), and Gemin4, at least, is also associated
  with nucleoli (116).

74
Application

• GEMS contient la protéine SMN (Survival of Motor
  Neurons)
• Certaines mutations du gène qui code pour cette
  protéine entraînent une atrophie musculaire
  spinale ?
• Défaut de l'assemblage de snRNP donc de
  l'épissage du pré-ARNm

75
Organisation architecturale du noyau

• La maturation de l'ARN est très importante ? on
  s'attend à une localisation spécifique de
  lépissage des pré-messagers MAIS
• l'épissage est co-transcriptionnel
• et la transcription se fait sur les chromosomes
  qui sont répartis dans tout le noyau
• MAIS
• Les chromosomes peuvent se déplacer

76
Organisation architecturale du noyau

• Les zones silencieuses transcriptionnellement
  sont localisées contre l'enveloppe nucléaire
  (beaucoup d'hétérochromatine)
• Ces mêmes régions se déplacent dans le noyau pour
  s'exprimer
• Il n'y aurait que quelques milliers de sites
  d'expression pour transcrire 15000 gènes dans le
  noyau

77
Organisation architecturale du noyau

• Sites dynamiques
• Transcription et épissage ?
• Lignes d'assemblage
• Factories

78
Comment les cellules lisent le génome de l'ADN
à la protéine

1. De l'ADN à l'ARN
2. De l'ARN à la protéine
3. Le monde de l'ARN et les origines de la vie