LE CYCLE CELLULAIRE

1
LE CYCLE CELLULAIRE
2
III - Contrôle intra-cellulaire des événements du
cycle cellulaire
3
Objectif

• Complexe Cdk - cycline facteur de déclenchement
  des événements du cycle
• Comment ?
• Dans le bon ordre
• Une seule fois par cycle
• Quatre événements
• Réplication de lADN en phase S et blocage de la
  re-réplication
• Entrée en phase M
• Séparation des chromatides
• Sortie de la mitose

4
Les trois grands acteurs

• Complexe S-Cdk
• Cycline A Cdk2 chez les vertébrés
• Clb 5, 6 Cdk 1 chez la levure
• Complexe M-Cdk
• Cycline B Cdk 1 (ex Cdc 2 !) chez les vertébrés
• Clb 1, 2, 3, 4 Cdk 1 chez la levure
• Anaphase Promoting Complexe (APC)

5
Quatre événements, quatre acteurs, quatre
paragraphes
A Complexe S-Cdk Réplication de lADN en phase S et blocage de la re-réplication
B Complexe M-Cdk Entrée en mitose
C Anaphase Promoting Complexe (APC) Séparation des chromatides sœur à la transition métaphase anaphase
D Complexe M-Cdk Sortie de la mitose
E F Sic1 et Hct1 Comment initialiser la phase S Phase G1 inactivité stable de Cdk
6
Table 17-1

• Composition de S-Cdk et M-Cdk des vertébrés et
  des levures bourgeonnantes

7
A - Complexe S-Cdk

• Réplication de lADN en phase S et blocage de la
  re-réplication

8
Expériences de fusion cellulaire

• G1 S ? G1 se réplique ? S contient S-Cdk
• G2 S ? Pas de synthèse dADN en G2
• G2 G1 ? Pas de synthèse dADN en G1

9
Fig 17-21

• Expériences (1970) de fusion cellulaire

10
Origin Recognition Complex (ORC)

• Gros complexe multiprotéique qui se fixe sur
  lorigine de réplication (chez la levure)
• Puis addition de nombreuses protéines
  régulatrices supplémentaires dont Cdc 6

11
Cdc 6

• Taux bas pendant le cycle cellulaire
• Augmentation transitoire en début de G1
• Se fixe à ORC
• Nécessaire à la liaison de protéines proches, les
  Mcm

12
Protéines Mcm(Minichromosome Maintenance)

• Maintien des minichromosomes circulaires dans la
  levure (en fait des plasmides)
• Se fixent à ORC grâce à Cdc 6
• ORC Cdc 6 Mcm pre-replicative complexe

13
Lei,M2001p1447 Initiating DNA synthesis from
recruiting to activating the MCM complex.J Cell
Sci 2001,114
Initialisation de la synthèse d'ADN, depuis le
recrutement jusqu'à l'activation du complexe MCM

• Fig. 1. Initiating DNA synthesis, from
  recruitment to activation of the MCM complex. (A)
  Assembly of the pre-RC begins during the G1
  phase, when Cdc6 and Cdt1 are recruited to
  replication origins to which ORC and Mcm10 bind.
  (B) Cdc6 and Cdt1 facilitate the loading of the
  MCM complex. Anchoring of the MCM complex is
  mediated through interaction between individual
  subunits of the MCM complex and multimers of the
  Mcm10 protein. Cdc6 is removed from origins once
  the MCM complex is recruited. The Cdc7-Dbf4
  kinase is also recruited to the origin during G1
  phase. (C) Phosphorylation of the MCM complex by
  Cdc7-Dbf4 occurs during S phase and is controlled
  locally at individual origins. Phosphorylation of
  the MCM complex is coupled to a conformational
  change in the complex that results in the melting
  of origin DNA. ORC and Mcm10 are hidden from
  view. (D) This conformational change is believed
  to convert the inactive MCM complex into the
  enzymatically active helicase, whose ring-shaped
  structure becomes topologically linked to DNA
  (Tye and Sawyer, 2000). Recruitment of Cdc45
  requires both the phosphorylation of the MCM
  complex and the activity of CDKs. Disassociation
  of the MCM helicase by Cdc45 from the Mcm10
  anchor initiates the melting of DNA and recruits
  RPA, DNA polymerase a, and primase to the origins
  for the initiation of DNA synthesis. (E) The
  melting of the dsDNA induces a conformational
  change in ORC before replication origins assume a
  post-replication chromatin state. Like the ORC,
  Mcm10 is believed to remain bound to origins
  throughout the cell cycle.

14
Mol Cell Volume 21, Issue 2 , 20 January 2006,
Pages 143-144 Christin A. Cvetic and Johannes C.
Walter Getting a Grip on Licensing Mechanism of
Stable Mcm2-7 Loading onto Replication Origins

• A Model for Mcm2-7 Loading by the ORC and Cdc6
  ATPases
• ATP bound ORC first binds origin DNA. Cdc6 then
  binds ORC and ATP. Cdt1 and Mcm2-7 (possibly as a
  complex) associate with ORC and Cdc6 at the
  origin. ATP hydrolysis by Cdc6 leads to the
  loading of Mcm2-7 complexes on DNA and the
  release of Cdt1 from the origin. Cdc6 association
  is destabilized by Cdc6 ATP hydrolysis. ATP
  hydrolysis by ORC completes the Mcm2-7 loading
  reaction allowing further rounds of Mcm2-7
  loading.

15
Fig 17-22

• Constitution du pre-replicative complexe (pre-RC)

Lorigine de réplication est prête à déclencher
la réplication
16
Arrive lactivation de S-Cdk

• Deux actions "contraires"
• 1 - Déclenchement de la réplication
• 2 - Blocage de la re-réplication

17
1 - Déclenchement de la réplication

• Déclenchement par S-Cdk en fin de G1
• Phosphorylation de ORC par S-Cdk et une autre
  protéine kinase

18
2 - Blocage de la re-réplication par S-Cdk

• Par la dissociation de Cdc 6 du ORC (donc plus
  de pre-RC ? plus de réplication)
• Phosphorylation de Cdc 6 ? ubiquitinylation par
  le complexe SCF ? dégradation de Cdc 6 dans un
  protéasome
• Phosphorylation de protéines Mcm ? exportation
  hors du noyau (intervention de G1/S-Cdk)

19
Fig 17-22

• Arrive lactivation de S-Cdk
• 1 - Déclenchement de la réplication
• 2 - Blocage de la re-réplication par S-Cdk

20
Inhibition de la re-réplication de l'ADN
intervention des autres Cdk pendant les autres
phases du cycle cellulaire

• S-Cdk
• Activité élevée pendant G2 et mitose précoce
• Empêche la re-réplication quand S est terminée
• Pendant la mitose
• M-Cdk
• phosphoryle Cdc 6 et les protéines Mcm
• donc empêche la re-réplication
• En fin de G1
• Aide à l'exportation des Mcm hors du noyau par
  G1/S-Cdk

21
Comment se fait la réplication au cycle suivant ?

• Réponse
• A la fin de la mitose, toutes les activités Cdk
  sont ramenées à zéro ?
• Déphosphorylation de Cdc 6 et Mcm ?
• Réassemblage de pre-RC (pre-replicative complexe)

22
B - Complexe M-Cdk

• Entrée en mitose

23
M-Cdk

• Accumulation de M-cycline ( cycline B des
  vertébrés)
• Par diminution de sa dégradation
• Par augmentation de la synthèse
• Accumulation de M-Cdk ( M-cycline Cdk 1)
• Cdk est soumis à deux régulations (c'est
  l'inhibition qui l'emporte)
• CAK qui phosphoryle et active
• Wee 1, protéine kinase qui exerce une
  phosphorylation inhibitrice à deux sites voisins

24
M-Cdk

• Accumulation de M-Cdk prêt à agir mais inhibé par
  la double phosphorylation inhibitrice maintenue
  par Wee 1
• En fin de G2 activation de Cdc 25 (protéine
  phosphatase)
• Qui retire les deux phosphates inhibiteur de
  M-Cdk
• En même temps l'activité de la kinase inhibitrice
  Wee1 est supprimée

25
Qu'est ce qui active Cdc 25 ?

• Deux protéine kinases
• Kinase Polo
• M-Cdk elle-même et M-Cdk phosphoryle et inhibe
  Wee 1
• M-Cdk
• Active son activateur (Cdc 25)
• Inhibe son inhibiteur ?
• Feed back positif ? activation de tous les
  complexes M-Cdk de la cellule ? explosion
  d'activité M-Cdk

26
Fig 17-23

• Activation de M-Cdk

• Il y a phosphorylation de M-Cdk en plusieurs
  endroits
• Sur un site dactivation par CAK
• Sur une paire de sites inhibiteur par Wee 1
  kinase
• Linhibition lemporte (? M-Cdk est inactive)

polo
(Dont la concentration augmente progressivement)
27
Point de contrôle de la réplication de l'ADN

• Permet d'éviter de faire entrer en mitose des
  cellules qui n'ont pas répliqué tout l'ADN
• Comment ?
• Soit détection de l'ADN non répliqué
• Soit détection d'une fourche de réplication en
  activité
• Bloque l'activation de M-Cdk (signal négatif)

28
Expériences

• Hydroxyurée bloque la synthèse de l'ADN ?
  activation d'un point de contrôle ? pas d'entrée
  en mitose (signal négatif)
• Caféine à fortes doses bloque le point de
  contrôle (signal négatif)
• Hydroxyurée caféine ? entrée en mitose malgré
  un ADN incomplètement répliqué ("mitose suicide")

29
Fig 17-24

• Point de contrôle de la réplication de l'ADN

30
Rôles de M-Cdk
Cest M-Cdk qui fait tout ça !

• A elle seule, elle déclenche tous les processus
  d'entrée en mitose
• Assemblage du fuseau
• Attachement des chromosomes au fuseau
• Condensation des chromosomes (condensines) ()
• Fragmentation de l'enveloppe nucléaire (lamina
  nucléaire)
• Réarrangement des filaments d'actine
• Réorganisation du Golgi
• Réorganisation de reticulum endoplasmique
• Réorganisation des microtubules
• Tout se fait par des phosphorylations de
  protéines spécifiques de l'événement

31
Fig 4-56

• () Condensines complexe de 5 protéines qui
  condensent le chromosome
• Phosphorylation par M-Cdk

32
C - Anaphase Promoting Complexe (APC)

• Séparation des chromatides sœur à la transition
  métaphase anaphase

33
Séparation des chromatides sœur

• A la transition métaphase anaphase
• Déclenchement par M-Cdk puis
• complexe Anaphase Promoting Complex (APC)
• Perte soudaine de la cohésion entre les
  chromatides par activation de APC

• Rappel les deux plus importantes ubiquitine
  ligases
• Complexe SCF(Skp1Cul1FBP F box protein)
• APC(anaphase promoting complex)

34
Anaphase Promoting Complex (APC)

• Ubiquitine ligase
• Complexe très différent de M-Cdk

35
Fig 17-20 B

• Anaphase Promoting Complex (APC)

36
Fig 18-3

• Cohésines (liaison des chromatides sœur)
• Condensines (condensation des chromosomes)

37
Fig 17-25

• Nécessité de la dégradation des protéines
• A Inhibiteur d'APC
• B Ajout de M-cycline non dégradable ? la
  destruction de M-cycline est
• non indispensable à la séparation des
  chromatides
• Indispensable à la sortie de mitose

38
Sécurine

• Cible de APC
• Avant l'anaphase se lie et inhibe la séparase

39
Séparase

• Protéase
• Inhibée par la sécurine

40
Réaction

• Activation de APC par Cdc 20 (cf infra)
• Destruction de la sécurine ?
• Libération de la séparase
• Phosphorylation du complexe cohésine (médiée par
  polo kinase) ?
• Clivage du complexe cohésine ?
• Les chromatides perdent leur cohésine et se
  séparent

41
Déclenchement de l'activation de l'Anaphase
Promoting Complex (APC)

• Nécessité de Cdc 20

42
Fig 17-26

• Déclenchement de la séparation des chromatides
  par APC

43
Régulation de Cdc 20

1. Synthèse qui augmente à l'approche de la mitose
   (par augmentation de la transcription)
2. Phosphorylation de APC

44
Quelles kinases phosphorylent et activent le
complexe Cdc 20 APC ?

• Quelles kinases phosphorylent et activent le
  complexe Cdc 20 APC ?
• M-Cdk ? Oui mais phase de latence
• Autre ?
• Inconnu et pourtant étape clé dans le
  déclenchement de l'anaphase pendant la phase M

45
Point de contrôle de l'attachement du fuseau

• Vérifie que tous les chromosomes sont attachés
  correctement au fuseau
• Se fait sur le kinétochore
• Un kinétochore mal attaché envoie un "signal
  négatif" qui bloque l'activation de Cdc 20 APC
• Quel "signal négatif" ?

46
Nature du signal négatif

• Mad2
• Se fixe sur un kinétochore libre
• Nécessaire au fonctionnement du point de contrôle
• Un seul kinétochore libre entraîne
• la liaison de Mad2 et l'inhibition de Cdc 20
  APC
• donc linhibition de la destruction de sécurine,
• donc linhibition de lactivation de séparase
• donc linhibition de la séparation des
  chromatides etc

47
Fig 17-27

• Prométaphase de cellule de mammifère
• Fuseau mitotique (vert)
• Chromatides sœur (bleu)
• AC anti Mad2 (rouge) sur le kinétochore de la
  seule chromatide non attachée

48
J. Cell Biol., Volume 141, Number 5, June 1, 1998
1181-1191.Localization of Mad2 to Kinetochores
Depends on Microtubule Attachment, Not Tension
Jennifer C. Waters, Rey-Huei Chen, Andrew W.
Murray, and E.D. Salmon

• Mad2 quitte les kinétochores au fur et à mesure
  que les MT s'y accumulent. On a marqué des
  cellules mitotiques PtK1 avec des AC dirigés
  contre Mad2 (orange/rose), contre la tubuline
  (vert), et l'ADN a été coloré au Hoechst
  33342 (bleu).)
• Juste après la rupture de lenveloppe nucléaire.
• Flèches blanches, accumulation de Mad2 sur les
  kinetochores
• pointes de flèches blanches, Mad2 sur des résidus
  denveloppes nucléaires.
• Prométaphase précoce.
• Green arrowhead, kinetochore fibers are visible
  as bright dense bundles of green microtubules
  that end abruptly on a chromosome
• white arrowhead, spindle pole.
• Milieu de prometaphase.
• White arrowhead, Mad2 on kinetochore
  microtubules.
• Prometaphase tardive.
• Métaphase.
• Anaphase.
• Yellow arrows, newly attached leading
  kinetochores on congressing chromosomes label
  brightly for Mad2
• purple arrows, trailing kinetochores on attached
  kinetochores label less brightly
• green arrows, attached kinetochores that lack
  Mad2 and
• red arrows, attached kinetochores on which some
  Mad2 is still visible.

49
Point de contrôle de la chronologie de l'anaphase

• Il n'y en a pas
• Si mutation du point de contrôle de l'attachement
  du fuseau, la chronologie de l'anaphase est
  normale (ou légèrement retardée chez les
  mammifères)

50
D - M-Cdk

• Sortie de la mitose
• Mitosis Exit Network (MEN)

51
Sortie de la mitose

• Après la ségrégation de l'anaphase,
• Il faut tout refaire en sens inverse
• Désassemblage du fuseau
• Décondensation des chromosomes
• Reconstruction de l'enveloppe nucléaire

52
Sortie de la mitose

• Entrée en mitose ? phosphorylation ?
• Sortie de mitose ? déphosphorylation des mêmes
  protéines ?
• Hypothèses
• Inactivation de M-Cdk (le plus important)
• Activation de phosphatases
• Les deux

53
Inactivation de M-Cdk

• Ubiquitinylation des cyclines M
• activées par le même complexe Cdc20-APC que
  celui qui détruit la sécurine à la transition
  métaphase anaphase

54
Fig 17-20

• Ubiquitinylation de la cycline M par APC
  (anaphase promoting complex)

55
Résumé sur Cdc20-APC

• Conduit à l'anaphase
• Conduit à l'inactivation de M-Cdk donc la sortie
  de mitose

56
Le "paradoxe" de M-Cdk en fin de mitose
2
1
Inactivation de M-Cdk
3
4

• L'inactivation de M-Cdk est due presque
  uniquement à l'action de Cdc20-APC
• M-Cdk stimule l'activité de Cdc20-APC
• "M-Cdk active sa propre destruction"

57
E - Phase G1 Hct1 et Sic1

• Inactivité stable de Cdk

58
(a) Embryon précoce sans phase G1

• Les deux données de base
• (Cdc20-APC inactive M-Cdk)
• (M-Cdk stimule Cdc20-APC)
• M-Cdk est haut ?
• Cdc20-APC augmente ?
• M-cycline (de M-Cdk) diminue ?
• inactivation de APC ?
• La cellule peut à nouveau accumuler de la
  M-cycline rapidement

59
Fig 17-28A
(a) Embryon précoce sans phase G1

• Création dune phase G1 stable cellules
  dembryon précoces sans phase G1

étaphase
60
(b) Cellules dont le cycle comporte une phase G1

• Laccumulation rapide de cycline nest pas
  nécessaire
• Il faut laisser le temps à la cellule de croître
• Il faut éviter la réactivation de M-Cdk à la fin
  de la mitose ? plusieurs mécanismes ?
• Protéine Hct1
• Protéines CKI (cdk inhibitor protein)
• Baisse de la transcription des gènes de cycline M

61
Les trois mécanismes pour supprimer lactivité de
M-Cdk en G1

1. Protéine Hct1 (? Cdc 20)
2. Augmentation de la production de protéines CKI
   (Cdk inhibitor protein eg Sic 1)
3. Baisse de la transcription des gènes de cycline M

62
1 - Protéine Hct1

• Proche de Cdc 20
• Active APC comme Cdc 20
• Toutefois
• Cdc 20-APC est activé par M-Cdk (accélérant la
  destruction de M-Cdk)
• Hct1 est inhibé par M-Cdk qui la phosphoryle
  directement ?
• Hct1-APC augmente en mitose tardive après la
  destruction de M-cycline par Cdc 20-APC ? la
  destruction de la cycline M continue après la
  mitose
• Bien que lactivité de Cdc 20-APC ait baissé
  lactivité de Hct1-APC reste élevée

63
Fig 17-28B

• Création dune phase G1 stable dans des cellules
  avec phase G1

64
Cellules avec phase G1

• La chute dactivité de M-Cdk en fin de mitose (à
  cause de Cdc20-APC)
• conduit à labsence de baisse de Hct1-APC (parce
  que M-Cdk inhibe Hct1-APC levée dinhibition)
• Garantissant une suppression continue de
  lactivité de M-Cdk après la mitose (parce que
  Hct1 active APC qui détruit la cycline M)

65
2 - Augmentation de la production de protéines
CKI (Cdk inhibitor protein)

• Rappel inhibition du complexe cycline A - Cdk2
  humain par une CKI (p27)

• Rappel régulation fine de Cdk
• 2 - protéines inhibitrices
• Protéines inhibitrices de Cdk "Cdk inhibitor
  proteins" (CKIs)
• Agissent sur le site actif de Cdk
• Exemple de CKI Sic1

66
Sic1

• Cest une Cdk Inhibitor protein (CKI)
• Étudiée chez la levure bourgeonnante
• Inactive M-Cdk en fin de mitose
• Inactivée par M-Cdk (comme Hct1)
• M-Cdk
• inhibe Sic1
• Inhibe un gène de synthèse de Sic1 ? diminution
  de la production ?
• Inhibition mutuelle de M-Cdk et Sic1
• Sic1 inhibe M-Cdk
• M-Cdk inhibe Sic1
• Comme pour M-Cdk et Htc1 (inhibition mutuelle)

67
3 - Baisse de la transcription des gènes de
cycline M

• Normalement M-Cdk active les gènes de cycline ?
  feed back positif
• Mais en fin de mitose
• Hct1 et Sic1 inactivent M-Cdk ?
• Diminution de la transcription des gènes de
  cycline

68
Résumé des trois mécanismes

• Lactivité de M-Cdk est supprimée par
• Lactivation de Hct1-APC
• Laccumulation de CKI
• Sic1 chez la levure
• p27 chez les mammifères
• La diminution de production de cycline
• ? mécanisme robuste
• Comment en sortir ??
• Il faut la synthèse de cycline G1 (cf. infra)

69
F - Comment initialiser la phase S

• Accumulation de cycline G1
• Non détruites par Hct1-APC
• Non inhibée par Sic1 ?
• Accumulation de G1-Cdk

70
Fig 17-29

• Contrôle de la progression de G1 par lactivité
  Cdk
• La cellule sort de mitose ? M-Cdk est inactif
• Hct1-APC et Sic1 peuvent augmenter ? inactivation
  stable de M-Cdk pendant G1.
• Les conditions pour lentrée dans un nouveau
  cycle se rassemblent ?
• G1-Cdk et G1/S-Cdk augmente ?
• Inhibition de Hct1-APC et Sic1 ? S-Cdk peut
  augmenter

71
Conséquences de laugmentation du complexe G1-Cdk

• Déclenche la transcription des gènes de la
  cycline G1/S ?
• G1/S augmente ?
• Formation de complexes G1/S-Cdk (qui sont
  résistants à Hct1-APC et Sic1) qui
• Font entrer la cellule en phase S
• Stimulent la transcription des gènes de cyclines
  S et la formation de complexes S-Cdk
• Ces complexes S-Cdk sont inhibés par Sic1
• Mais G1/S-Cdk phosphoryle et inactive Sic1 (et
  Hct1-APC) ?
• Activation de S-Cdk

72
Conclusion sur le passage dun G1 stable à S

• Cest la même boucle qui
• déclenche linactivation de M-Cdk en mitose
  tardive
• et qui active rapidement et complètement S-Cdk en
  fin de G1
• mais en sens inverse

73
Cardozo,T2004p739 Nat Rev Mol Cell Biol
CDK activity profilesCardozo,T2004p739 Nat Rev
Mol Cell Biol

• Cyclin-dependent kinases (CDKs) represent both
  the engine and the pacemaker of the cell cycle.
  It is now clear that proteolysis is a significant
  force that imposes the required checks and
  balances on this engine. During G1, Cdk1 and Cdk2
  need to be idle to avoid premature DNA synthesis
  and mitosis (see figure, panel a). Starting at
  the G1S checkpoint the point at which DNA
  replication and centrosome duplication begins
  Cdk2 markedly increases its activity (see figure,
  panel b). The activity of Cdk2, and therefore the
  phosphorylation of its substrates, builds to a
  peak through the DNA-synthesis and
  centrosome-duplication phase into G2, at which
  point the activity of Cdk2 is attenuated again.
  The coincidence of peaking Cdk2 activity and
  peaking activity of the DNA-replication and
  centrosome-duplication machinery indicates that
  Cdk2 somehow releases and maintains the nuclear
  environment that is necessary for the synthetic
  machinery to function. Although Cdk2 seems to be
  the optimal agent for this purpose, it is not
  absolutely required. Low Cdk1 activity and/or the
  action of other CDKs contribute to these
  processes, and can accomplish them in the absence
  of Cdk2, at least under normal cellular
  conditions3.

74
Dia de transition G1 stable ? Rb
75
Protéine Rb

• Rappel suppression de l'activité de M-Cdk en G1
  par
• Activation de Hct1
• Accumulation de CKI
• Sic1 chez la levure
• p27 chez les mammifères
• Inhibition de la transcription des gènes de
  cycline
• Activation du complexe G1-Cdk en fin de G1?
• Inversion des 3 mécanismes

76
G1-Cdk

• Les effets les mieux connus de G1-Cdk sont médiés
  par E2F

77
E2F

• Protéine régulatrice de gène
• Sert de médiateur à l'activité de G1-Cdk
• Se fixe sur des promoteurs d'ADN codant pour des
  protéines nécessaires à l'entrée en phase S dont
  les cyclines G1/S et S
• E2F est contrôlé par la protéine du
  rétinoblastome Rb

78
Protéine Rb

• Inhibiteur de la progression du cycle cellulaire
• Pendant G1
• Rb se lie à E2F,
• et bloque la transcription des gènes de la phase
  S
• Signaux extra cellulaires ?
• Accumulation de G1-Cdk ?
• Phosphorylation de Rb ?
• Diminution de l'affinité de Rb pour E2F ?
• Dissociation de Rb ?
• E2F active l'expression des gène de la phase S

79
Fig 17-30

• Contrôle de l'initiation de la phase S dans les
  cellules animales
• Phosphorylation de Rb par G1-Cdk ? inactivation
  de Rb ?
• Libération de E2Fqui active la transcription des
  gènes de la phase S dont G1/S-cycline et
  S-cycline qui augmentent donc et augmentent la
  phosphorylation de Rb ?
• Feed back positif. (Autre feed back positif de
  E2F sur lui-même)

G1-Cdk cycline D - Cdk4 G1/S-cycline cycline
E S-cycline cycline A
80
Les boucles de feed back

• E2F augmente sa propre synthèse (positif)
• E2F? transcription de G1/S cycline et S-cycline ?
  activité de G1/S-Cdk et S-Cdk phosphorylation de
  Rb ? libération de E2F ? transcription de G1/S
  cycline et S-cycline ? activité de G1/S-Cdk et
  S-Cdk phosphorylation de Rb ? libération de E2F ?
  etc (positif)
• Activation de G1/S-Cdk et S-Cdk ? phosphorylation
  de Hct1 et p27 ? destruction de G1/S-Cdk et S-Cdk
  (négatif)

81
Résultat final

• Activation rapide et complète du complexe S-Cdk
  nécessaire à l'initiation de la phase S

82
Rétinoblastome

• Cancer de la rétine chez l'enfant
• La perte des deux copies du gène Rb1 conduit à
  une prolifération excessive de la rétine immature
• La perte complète du gène est compensée au début
• par Hct1 et p27 dans les autres types de cellules
• Et des protéines proches de Rb

83
DeGregori,J2004p3411
No Caption Found
DeGregori, J. J Cell Sci 20041173411-3413
84
DeGregori,J2004p3411
85
Coordination croissance prolifération

• Nécessité dune phase suffisamment longue pour
  multiplier le nombre de molécules par deux
• Cycle trop court ? cellule trop petite
• Cycle trop long ? cellule trop grosse
• ? rôle de lenvironnement sur le cycle
• Grâce à cycline 3 (Cln3 chez la levure ? cycline
  D des vertébrés)

86
Fig 17-31

• Contrôle de la taille de la cellule (levure) via
  le cycle cellulaire en cas de nutrition
  insuffisante
• A Si taux de division cellulaire constant ?
  diminution de la taille de la cellule
• B La cellule ralentit le cycle pour maintenir sa
  taille

87
Cycline Cln3 chez la levure (? cycline D des
vertébrés)

• Cest une cycline G1
• Taux de synthèse parallèle à la croissance de la
  cellule (la quantité augmente mais la
  concentration reste constante)
• Si on augmente artificiellement Cln3 la cellule
  se divise en deux cellules plus petites
• Si on diminue artificiellement Cln3 la cellule se
  divise en deux cellules plus grosses
• ? la cellule entre en division à partir dun
  certain seuil de Cln3

88
Comment gérer la quantité de Cln3 plutôt que sa
concentration ?

• Hypothèse la cellule aurait hérité dune
  quantité fixe dun inhibiteur qui se lierait et
  bloquerait lactivité de Cln3
• Quand Cln3 dépasse linhibiteur, elle déclenche
  lactivation de G1-Cdk ? nouveau cycle
• Nature de cet inhibiteur en quantité constante ?
• ADN lui-même ?
• Ou protéine liée à lADN ?

89
Fig 17-32

• Coordination croissance cycle cellulaire
  (prolifération) hypothèse
• Nombre fixe de protéines liées à lADN et qui
  inhibent Cln3
• Quand la cellule croît le nombre de molécules de
  Cln3 augmente ? seuil ? activation de Cdk
• Expliquerait pourquoi les cellules polyploïdes
  sont plus grosses

90
Exceptions à la coordination croissance ?
prolifération

• Levure la croissance se fait en fonction des
  nutriments extérieurs
• Cellule animale présence de signaux qui
  stimulent croissance et prolifération
• Croissance et prolifération peuvent évoluer de
  façon indépendante ?
• Croissance sans division ou
• Division sans croissance
• Œuf de xénope
• Au début (avant fécondation) croissance sans
  division
• Puis (après fécondation) division sans croissance

91
Les points de contrôle des dommages de lADN

• Il existe des points de contrôle de lintégrité
  de lADN
• Si lADN est altéré il faut attendre quil soit
  réparé avant de le répliquer ?
• au moins deux points de contrôle pour stopper le
  cycle
• Un en fin de G1 (bloque l'entrée en phase S)
• Un en fin de G2 (bloque l'entrée en mitose)

92
1 - Point de contrôle en fin de G1 pour bloquer
l'entrée en phase S

• Au point G1 tardif inhibition de l'activation
  des complexes G1/S-Cdk et S-Cdk
• eg Altération de l'ADN ? activation de la
  protéine régulatrice de gène p53 qui stimule la
  transcription de gènes dont la CKI p21 qui se lie
  à G1/S-Cdk et S-Cdk et inhibe leur action ?
  blocage de l'entrée en phase S
• Comment ?? Par un mécanisme indirect

93
Comment une altération de l'ADN active-t-elle p53
?

• Dans une cellule normale
• p53 est instable et à faible concentration car
  interagit avec Mdm2 qui se comporte comme une
  ubiquitine ligase
• Si lésion de l'ADN
• Activation de protéines kinases qui phosphorylent
  p53 ?
• Affaiblissement de sa liaison avec Mdm2 ?
• Diminution de la dégradation de p53 ?
• Augmentation de la p53 dans la cellule ?
• Activation de CKI (p21) etc cf. supra

94
Proto-Oncogene Proteins c-mdm2

• An e3 ubiquitin ligase that
• interacts with and
• inhibits tumor suppressor protein p53.
• Its ability to ubiquitinate p53 is regulated by
  tumor suppressor protein p14arf.

95
Int J Biochem Cell Biol. 200739(7-8)1476-82.MDM
2 and MDM4 p53 regulators as targets in
anticancer therapy.Toledo F, Wahl GM.
A dynamic model of the p53 response integrating
the distinct and complementary roles of MDM2 and
MDM4

• A dynamic model of the p53 response integrating
  the distinct and complementary roles of MDM2 and
  MDM4.
• (a) In unstressed cells p53 is kept at low levels
  (due to MDM2-mediated degradation) and inactive
  (primarily due to MDM4-mediated occlusion of the
  p53 TAD). In this diagram, p53 stability is
  represented by a blue circle and p53 activity by
  a green star, and MDM2 (2) and MDM4 (4) levels
  are represented by red and orange ovals,
  respectively.
• (b) After stress, MDM2 degrades itself and MDM4
  a transcriptional stress response (diagrammed
  below) is mounting.
• (c) Increased MDM2 levels, resulting from p53
  activation, lead to a more efficient MDM4
  degradation, enabling full p53 activation the
  transcriptional response is maximal.
• (d) Following stress relief, accumulated MDM2
  targets p53 again, and as MDM4 levels also
  increase, p53 activity decreases, so that the
  stress response is fading. This may allow cell
  cycle re-entry (grey arrow). As discussed in the
  text, the switch that makes MDM2 preferentially
  target p53 for degradation in unstressed cells
  (a), then target itself and MDM4 after stress (b
  and c) then target p53 again after stress relief
  (d) is proposed to result from the regulated
  deubiquitination of p53, MDM2 and MDM4 by HAUSP,
  a process also involving the adaptor protein Daxx.

96
Fig 17-33

• Blocage en G1 par une lésion de l'ADN

97
Moll,UM2003p1001(fig1)

• Molecular Cancer Research Vol. 1, 10011008,
  December 2003
• Ute M. Moll and Oleksi Petrenko
• The MDM2-p53 Interaction
• FIGURE 1. Regulation of p53 by MDM2. p53 and MDM2
  form an autoregulatory feedback loop. p53
  stimulates the expression of MDM2 MDM2, in turn,
  inhibits p53 activity because it stimulates its
  degradation in the nucleus and the cytoplasm,
  blocks its transcriptional activity, and promotes
  its nuclear export. A broad range of DNA damaging
  agents or deregulated oncogenes induces p53
  activation. DNA damage promotes phosphorylation
  of p53 and MDM2, thereby preventing their
  interaction and stabilizing p53. Likewise,
  activated oncogenes induce ARF protein, which
  sequesters MDM2 into the nucleolus, thus
  preventing the degradation of p53. Conversely,
  survival signals mediate nuclear import of MDM2
  via Akt activation, which destabilizes p53.

98
Chene,P2003p102 Nat Rev Cancer
The p53-mediated response

• Figure 1 The p53-mediated response. p53 exists
  in nonstressed cells at a very low concentration.
  Under stress conditions, the p53 protein
  accumulates in the cell, binds in its tetrameric
  form to p53-response elements and induces the
  transcription of various genes that are involved
  in cell-cycle control, apoptosis, DNA repair,
  differentiation and senescence. The loss of p53
  tumour-suppressor activity by mutation/deletion
  of TP53 or inhibition of p53 allows the
  proliferation of the cells that are damaged under
  the stress conditions. This uncontrolled
  proliferation can lead to tumour development.

99
Chene,P2003p102 Nat Rev Cancer
Regulation of p53 by Mdm2

• Figure 2 I Regulation of p53 by M DM2. p53 and
  MDM2 form an auto-regulatory feedback loop. p53
  stimulates the expression of MDM2 MDM2 inhibits
  p53 activity because it blocks its
  transcriptional activity, favours its nuclear
  export and stimulates its degradation. Different
  cellular signais, such as DNA-damage or oncogene
  activation, induce p53 activation. DNA damage
  favours p53 phosphorylation, preventing its
  association with MDM2. Activated oncogenes
  activate the ARF protein, which prevents the
  MDM2-mediated degradation of p53. Similarly,
  inhibitors of the p53-MDM2 interaction should
  activate p53 tumour-suppressor activity in tumour
  cells that express wild-type p53. These
  compounds, because they bind to MDM2, could also
  affect the p53independent activities of MDM2.

100
Chene,P2003p102 Nat Rev Cancer
Structure of the p53MDM2 complex

• Figure 3 Structure of the p53MDM2 complex. a
  The surface of MDM225109 is in white and the
  backbone of p531729 is in green. Two different
  views of the complex are presented, and the amino
  (N) and carboxyl (C) termini of the p53 peptide
  are indicated. b The p531729 backbone is in
  grey and the side chains of Phe19, Trp23 and
  Leu26 are represented. The surface of MDM225109
  is in yellow.

101
2 - Point de contrôle en fin de G2 pour bloquer
l'entrée en mitose

• Mécanisme semblable à celui qui bloque l'entrée
  en mitose en réponse à une réplication incomplète
  de l'ADN
• Si ADN altéré par radiation eg, l'ADN lésé envoie
  un signal qui aboutit à la phosphorylation et
  l'inactivation de la phosphatase Cdc 25 ?
• Blocage de la déphosphorylation et de
  l'activation de M-Cdk (cf. Activation de M-Cdk) ?
• Blocage de l'entrée en mitose

102
"Application au cancer"

• Cellule normale conditions normales ? les
  points de contrôle n'ont pas besoin de
  fonctionner
• Si petit dommage à l'ADN point de contrôle non
  fonctionnel ? accumulation de petits dommages ?
• gros dommages ? augmentation de la fréquence des
  mutations génératrices de cancer

103
Exemple

• Des mutations du gène de p53 surviennent dans au
  moins la moitié des cancers ?
• Accumulation plus facile de mutations dans les
  cellules cancéreuses par perte de la fonction de
  la p53

104
Ataxie télangiectasie

• Maladie génétique rare
• Altération d'une des protéines kinases qui
  phosphoryle et active p53 en réponse à une lésion
  d'ADN radio-induite
• Perte des points de contrôle d'altération de
  l'ADN ?
• Fréquence accrue de cancer chez ces patients très
  sensibles aux RI

105
Réparation de l'ADN

• Organismes unicellulaires
• Arrêt du cycle pour réparer la lésion
• Si réparation impossible ? le cycle se poursuit
  quand même
• "La vie vaut mieux que pas de vie du tout"
• Organismes multicellulaires
• "L'organisme prévaut sur la cellule"
• Une cellule atteinte menace l'individu (cancer)
• On suicide la cellule en exécutant un programme
  de mort cellulaire (apoptose)

106
Importance de p53

• Rôle dans la décision d'exécuter l'apoptose
• Rôle de protection contre le cancer

107
Tableau résumant les principales protéines
régulatrices du cycle cellulaire
108
Table17-2

• Tableau résumant les principales protéines
  régulatrices du cycle cellulaire

109
Fig 17-34

• Survol du système de contrôle du cycle cellulaire
• "Core" suite de complexes cycline-Cdk
• Toutes les cellules n'ont pas tout !

110
Résumé du cycle cellulaire
111
Virchows Arch (2004) 444313323 Mathewos Tessema
Ulrich Lehmann Hans Kreipe. Cell cycle and no
end

• Fig. 1 Negative and positive regulators of the
  normal cell cycle. Signals promoting and
  inhibiting the different phases of the cell cycle
  as well as checkpoints monitoring the proper
  completion of every phase of the cell cycle are
  indicated. In the centre of the cycle, the
  CDK/cyclin complexes driving the respective phase
  are shown. For details, see the text

112
Understanding the cell cyclePaul Nurse et
al.Nature Medicine 4, 1103 - 1106 (1998)

• The pattern of the progress in understanding cell
  division.

113
Understanding the cell cyclePaul Nurse et
alNature Medicine 4, 1103 - 1106 (1998)

• Changes in maturation-promoting factor (MPF) and
  cytostatic factor (CSF) activities during meiotic
  divisions of oocytes and mitotic divisions of
  early zygotes.