Microscopia Confocal: Teoria e t

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Microscopia Confocal Teoria e técnica

• 1. Energia radiante Radiação eletromagnética
• Natureza da radiação eletromagnética
• Espectro eletromagnético.
• Natureza dual onda/partícula
• 2. Fluorescência.
• Interação radiação eletromagnética-matéria.
• Luminescência fluorescência e fosforescência.
• Fluorescência Diagrama de Jablonski.
• Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão
• 4. Microscopia de fluorescência wide-field
• 5. Microscopia confocal
• 6. Técnicas especiais proteínas de fusão.

2
Práticas

• Microscopia de transmissão
• Microscopia de fluorescência wide-field
• Microscopia confocal

Bibliografia Lakowicz, J.R. Principles of
Fluorescence Spectroscopy. 2nd Edition. 1999.
Kluver Academic/Plenum Publishers, New
York. Lichtman, J.W., Conchello, J-A.
Fluorescence microscopy. Nature Methods,
2(12)910- 919, 2005. Conchello, J-A., Lichtman,
J.W. Optical sectioning microscopy. Nature
Methods, 2(12)920-931/
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Microscopia Confocal Teoria e técnica

• 1. Energia radiante Radiação eletromagnética
• Natureza da radiação eletromagnética
• Espectro eletromagnético.
• Natureza dual onda/partícula
• 2. Fluorescência.
• Interação radiação eletromagnética-matéria.
• Luminescência fluorescência e fosforescência.
• Fluorescência Diagrama de Jablonski.
• Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão
• 4. Microscopia de fluorescência wide-field
• 5. Microscopia confocal
• 6. Técnicas especiais proteínas de fusão.

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Ondas mecânicas em um meio elástico
Meio Massa (inércia) Elasticidade
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Energia Radiante Radiação eletromagnética.
Carregam energias elétrica e magnética

• Propriedades do meio de propagação
• Armazenar energia elétrica (capacitância)
• Armazenar enérgia magnética
• (indutância)

Vácuo Permitividade e08.8510-12F/m Permeabil
idade m04p10-12 H/m
6
Energia Radiante Radiação eletromagnética.
Velocidade da onda
Frequência (ciclos por s, Hz)
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Espectro da radiação eletromagnética
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Onda Refração
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Fóton
 photon is the quantum of the electromagnetic
interaction and the basic "unit" of light and all
other forms of electromagnetic radiation and is
also the force carrier for the electromagnetic
force.
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Microscopia Confocal Teoria e técnica

• 1. Energia radiante Radiação eletromagnética
• Natureza da radiação eletromagnética
• Espectro eletromagnético.
• Natureza dual onda/partícula
• 2. Fluorescência.
• Interação radiação eletromagnética-matéria.
• Luminescência fluorescência e fosforescência.
• Fluorescência Diagrama de Jablonski.
• Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão
• 4. Microscopia de fluorescência wide-field
• 5. Microscopia confocal
• 6. Técnicas especiais proteínas de fusão.

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Interação radiação EM-matéria reflexão
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Interação radiação EM-matéria refração
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Interação radiação EM-matéria difração
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Luminescência Fluorescência e fosforescência
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(No Transcript)
16
Luminescência Fluorescência e fosforescência
Diagrama de Jablonski
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Fluoróforos de interesse em Biologia
Quinina
Fluoresceína
lexc490nm lem514nm
Rodamina
Acridina
lexc495nm lem526nm
lexc530nm lem556nm
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Fontes de luz Laser x HBO
Espectro do He-Ne laser
Laser (Light Amplification by Stimulated Emission
Radiation)
Laser é um instrumento óptico-eletrônico que
emite radiação coerente (fase relativa
constante), em um feixe estreito, de baixa
divergência, em um comprimento de onda definido
(monocromático)
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Microscopia Confocal Teoria e técnica

• 1. Energia radiante Radiação eletromagnética
• Natureza da radiação eletromagnética
• Espectro eletromagnético.
• Natureza dual onda/partícula
• 2. Fluorescência.
• Interação radiação eletromagnética-matéria.
• Luminescência fluorescência e fosforescência.
• Fluorescência Diagrama de Jablonski.
• Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão
• 4. Microscopia de fluorescência wide-field
• 5. Microscopia confocal
• 6. Técnicas especiais proteínas de fusão.

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Dimensões na Biologia
21
Microscopia - Objetivas
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Abertura numérica e aumento
23
Resolução
24
Difração limita a resolução Airy disks
25
Resolução e refração do meio
26
Resolução
27
Aumento e Resolução
28

Microscopia de luz refletida
29
Microscopia de luz transmitida
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Iluminaçao Sistema Köhler
31
Técnicas especiais Contraste por Interferência
DiferencialDIC
32
Técnicas especiais Contraste por Interferência
DiferencialDIC
33
Imagem de Fluorescência em Microscopia Wide
Field
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Fluorescência
35
Microscopia de fluorescência wide field
36
Imagem de Fluorescência em Wide FieldFilter
Cube
37
Imagem de Fluorescência
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Microscópio de epifluorescência Wide Field
UV Filter Cube set 487902 (Exciter Filter G
365, Beam Splitter FT 395, Barrier Filter LP
420). This cube is used to visualize UV-excitable
fluors like DAPI. Blue Filter Cube set 487910
(Exciter Filter BP 450-490, Beam Splitter FT
510, Barrier Filter BP 515-565). Fluorescein,
GFP and Oregon Green can be visualized using this
filter set. Green Filter Cube set 487915
(Exciter Filter BP 54612, Beam Splitter FT
580,Barrier Filter LP 590). Green-excitable
fluors like rhodamine and Cy3 can be visualized
using this filter set.
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Espectro da HBO
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Zeiss Axiovert 100 M
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Microscópio Confocal
Microscópio de fluorescência a laser com
iluminação puntiforme Microscópico de
varredura Fatiamento óptico produz qualidade de
imagem superior à da epifluorescência Resolução
no eixo Z Resolução temporal reduzida.
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Microscópio Confocal aplicaçoes
As que demandam resoluçao espacial
XYZ Investigação de colocalização de moléculas
que possam ser identificadas por indicadores
fluorescentes Análise da interação entre
moléculas (FRET) Análise da migraçao de moléculas
(FRAP) etc
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Microscopia confocal
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Princípio da Microscopia confocal
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(No Transcript)
46
Imagem multiespectral
47
(No Transcript)
48
Resoluções lateral e axial
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Resolução e Airy pattern
50
Compromissos
51
(No Transcript)
52
Aplicações do microscópio confocal
53
(No Transcript)
54
Espectros das FP
55
(No Transcript)
56
(No Transcript)
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Inclusões

• Análise espectral META (lambda stack - AOTF)
• Proteínas fluorescentes (http//dwb.unl.edu/Teache
  r/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/
  gmocz/index.htm)