Universidade Estadual do Cear

1
Universidade Estadual do Ceará UECE Centro de
Ciências da Saúde - CCS Curso Ciências
Biológicas Disciplina Bioquímica Professor Luís
Flávio
ELETROFORESE (Em gel de agarose)?
Elitha Gardênia Paulino Stela Mirla
Acácio Fortaleza 2010
2
Conceito
Eletroforese em gel é uma técnica de separação
de moléculas que envolve a migração de partículas
em um determinado gel durante a aplicação de um
potencial elétrico. As moléculas são separadas de
acordo com a sua carga elétrica e seu peso
molecular, logo as de menor massa irão migrar
mais rapidamente que as de maior massa. A
eletroforese normalmente é utilizada para separar
proteínas e moléculas de DNA e RNA.
3
Breve Histórico...

• Inicialmente proposta por Arne Teselius (1937).
• A eletroforese era técnica empregada para
  visualização de proteínas com suas diferenças de
  comprimento de fragmentos de aminoácidos e cargas
  elétricas.
• Atualmente, o uso desta técnica é comum também
  para estudos com ácidos nucléicos (Brown 1998
  Farah 2000), na visualização de material genético
  (ácido desoxirribonucléico e ribonucléico, DNA e
  RNA).
• Arne Tiselus
• Prêmio Nobel de
• Química em 1948

4
Princípios da Eletroforese
O princípio da eletroforese utilizada para
separação de DNA, baseia-se na carga total
negativa do DNA (dada pelos oxigênios do
grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA
obtidos da técnica de PCR, podem ser separados
pela aplicação de uma voltagem. Ao final do
processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao
pólo positivo.
5
Princípios da Eletroforese
1.Separar partículas por diferença de carga e
massa 2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre o
gel 3.Isolar fragmentos de DNA, RNA e proteínas
6
Equipamentos

• Cuba Eletroforética
• Fonte de eletricidade
• Suporte para o gel
• Pentes
• Pipetas

7
Equipamentos
8
Equipamentos
9
Gel de Agarose

• Agarose é um polissacarídeo extraído de alga
  marinha.
• Não-tóxico.
• Fácil de preparar.
• Possuem ampla capacidade de separação,mas baixa
  resolução.
• Dependendo da concentração podem separar
  fragmentos de DNA de 200 a 50.000 bp, via
  eletroforese.
• Custo elevado.
• Ao solidificar, após o aquecimento, os longos
  filamentos de agarose formam uma matriz (malha)
  que serve de "peneira" de separação de fragmentos
  de DNA.
• .

10
Gel de Agarose

• Alguns fatores determinam a migração do DNA
  através do gel de agarose
• a) tamanho da molécula de DNA
• b) concentração da agarose
• c) conformação do DNA
• (formas circulares ou lineares)
• d) a presença de brometo de etídio no
  gel
• e) voltagem aplicada
• f) tipo de agarose
• g) tipo do tampão de eletroforese

11
Soluções e Reagentes

• Tampão
• O gel é submerso em um tampão que possui íons
  para a corrente passar e também para manter o pH
  mais ou menos constante.
• a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis
  buffer Tampão de eletroforese-Tris-acet
  ato-EDTA)
• b) TPE (Tris-phosphate-EDTA
  lectrophoresis buffer Tampão de
  eletroforese-Tris-fosfato-EDTA)?
• c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis
  buffer
• Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDTA
  )?

12
Soluções e Reagentes

• Tampão de carregamento (loading buffer)?
• É uma solução composta de azul de bromofenol
  (e/ou xileno cianol ) e glicerol, é misturado às
  amostras antes de carregar o gel e possui três
  finalidades
• 1) aumentar a densidade da
  amostra
• 2) adicionar cor às amostras
• 3) simplificar o processo de
  carregamento

13
(No Transcript)
14
Soluções e Reagentes

• Coloração do gel
• 1) Brometo de etídio
• O brometo de etídio intercala-se com a
  molécula de DNA a cada 2,5 bp do fragmento, após
  sua inserção esse exerce uma ligação do tipo Van
  der Waals. A radiação UV é capaz de estimular
  essa ligação entre o DNA e o corante tornando a
  molécula ou banda visível no gel através de um
  dispositivo de transiluminação.
• Como o brometo de etídio se intercala no DNA,
  esta substância tem um poderoso efeito mutagênico
  e, possivelmente pode ser cancerígeno ou
  teratogênico.

15
(No Transcript)
16
Marcadores de peso molecular
A distância que o fragmento percorre a
partir do ponto de aplicação é comparada com a
distância que outros fragmentos de tamanhos
conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses
fragmentos são os ladders (marcadores de peso
molecular), misturas de segmentos de DNA de
tamanhos variáveis e eqüidistantes entre si, e
que são aplicados em um poço no gel no início do
processo.
.
17

• Montando a Eletroforese
• Preparação do Gel de Agarose
• 1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose.
• 2. Adicionar 100mL de TAE 1X.
• 3. Fundir a solução no microondas até
  homogeneizar
• (sugestão 2 a 2,5 min, potência 7).
• 4. Enquanto a solução de gel esfria (morno),
  preparar o suporte
• de gel, selando as laterais com fita crepe ou na
  própria cuba.
• 5. Acrescentar 5µL de Brometo de Etídeo (10mg/mL)
  e misturar
• com agitação leve.
• 6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer
  bolhas.
• 7. Colocar o pente da espessura desejada no
  suporte.
• 8. Esperar a solução solidificar.
• 9. Colocar o suporte com o gel na cuba de
  eletroforese.

18

• Montando a Eletroforese
• Preparação das Amostras (DNA)
• 1. Extrair 3µL da amostra de DNA.
• 2. Homogenizar com 1µL de tampão de corrida 5X
• (Loading Buffer).
• 3. Aplicar as amostras nos poços.
• 4. Reservar 2 poços para utilização de um padrão
  de corrida
• (Ladder-1Kb).

19

• Montando a Eletroforese
• Montar a Cuba Eletroforética
• Adicionar o gel, previamente preparada
• Adicionar tampão TAE 1X até cobrir a
• superfície do gel.
• Adiciona as amostras a serem separadas
• Ajustar a voltagem desejada(média 80v)
• e ligar a cuba

20
(No Transcript)
21
Eletroforese em gel

• Eletroforese em gel de poliacrilamida a
  poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros,
  acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma
  molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é
  em forma de "T". Misturando essas duas moléculas,
  temos a formação de uma "rede".O gel de
  poliacrilamida tem maior capacidade de resolução
  e é mais efetivo para separar pequenos fragmentos
  de DNA (5-500 bp pares de base).
• Eletroforese Desnaturante normalmente feita em
  gel de agarose, inclui um agente desnaturante
  (normalmente uréia), o que ajuda a tornar a
  separação melhor entre moléculas que apresentam
  diferenciação em suas estruturas secundárias.

22
Eletroforese em Gel

• Eletroforese capilar Funciona como a
  eletroforese normal, porém o gel e a amostra
  estão dentro de um capilar, e a amostra é
  detectada automaticamente por um detector. Isso
  possibilita a automação do processo. Essa é a
  eletroforese atualmente utilizada em
  seqüenciadores de DNA.

23
Visualização após a Eletroforese
.
Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e
olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.
24
Visualização após a Eletroforese
.

25
Visualização após a Eletroforese
.

26
Visualização após a Eletroforese
.

27
.

Visualização após a Eletroforese SYBR Green gt
Molecular Probes 1995
Revolucionou a detecção de DNA em géis. A
intensidade da fluorescência do SYBR Green é
aumentada em 100X quando se liga ao DNA.
Consegue-se ver picogramas de DNA. Junto a
sua sensibilidade superior o SYBR Green tem
outras vantagens sobre o EtBr - É muito
menos mutagênico, - Pode ser adicionado
diretamente à amostra antes da eletroforese.
28
O homem que à ciência quer dedicar seu tempo e
amor, tem pelo menos três certezas na vida
primeira, que morrerá como todo mundo segunda,
que não ficará rico, como quase todo mundo e, por
fim, que se divertirá muito, como pouca gente.
Prof. Dr. Newton Freire. Departamento
de Genética UFRS.
29
OBRIGADA!!! diponível em www.mirla.com.br