Principe de la PCR

1
???????????? ?????? ???????

• ?????, ??????? ??????????
• ??????????? ???????????? ????????

2
???????

• ????????????? ?????? ??? ? ??????????????
  ????????? ??? ?????? ??? ? 1971 ?. Kleppe et al.
• ? 1983 ?. Kary Mullis ????????? ?????,
  ?????????????? ?????????? (????????????)
  ?????????????? ????????? ???, ?????????? ????????
  ???????????? ?????? ??????? (??????????? ??????
  ?? ????? 1993 ?).
• ??????? ??????? ??????????? ? 1985 ?
• Science. 1985 Dec 20230(4732)1350-4.

3
??????????????? ?????? ???
??? ????? ??????????
1985 1
1986 3
1987 8
1988 139
1989 698
1990 2 668

1995 11 890

2000 16 430

2004 20 075
4
???????? ??????????? ???

• ??????? ????????????????
• ??????? ?????????????
• ?????? ? ??????????
• ??? ????????????? ? ????????? ??? ??????? ???????
  ????????? ???
• ??????????? ?????? ? ??????????? ?????
  ????????????? ??????????

5
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• ??????? ????? ????????? ??????? ?????
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• ?????? ??????? ????????, ??????????????
• ???????? ???

6

• ?????????? ??? in vivo

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7

• I. ?????????? ????? (???????????)

95C
8

• II. ????? ?????????
• III. ?????? ??? (????????? ????)

???????
9
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• ??????????? (94C)
• ???????????? ?????????? ????? ???
• ???????????? (?????) ????????? ?? ???????
  (45-65C)
• ????????? ????????? ?????????? ???-???????????
• ?????? (?????????) ???? (72C)
• ?????????? ?????? ??????????????? ????? ?
  ????????? ????? ??????? ??? ??????

10
????? ???
1 ????? (???????)
???????????
????? ????????? ??????
2 ?????
11
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??????????? ????? ??????
???????? ????? 2-?? ????? ???????
??????? ???
12
???????? ???????? ???

• ???????????? ????????? ?????????? ????? ?????
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• ?????? ???? ??????? ?? ????? ?????????????
  ???????
• ? ??????? ?????????? ???????????????
  ???-??????????
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  ???????????????? ????????? ??? ? 1 000 000 000
  ???
• ???????? ??? ??????????????? ??????? ?? ?????

13
(No Transcript)
14
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• ????????? ?????????? (???? ? ?????????)
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• ?????????? ???????????, ??????? ??????????? ?
  ???-????????
• ??????????? ?? ????????? ????????????????
  ?????????? ??? ???????-????????
• ???????????? ?????????????? ???????? ? ????????
  ??????????? ??? ??????? ???????????? ?????????
  ????????????.

15
?????????? ???????

• ????? (Tris-HCl, pH 8,0-8,8 KCl)
• MgCl2 (1-3 mM)
• ???????? (0.4 ??? ???????)
• dNTP (40-200 ??? ???????)
• ???-?????????? (1 ??)
• ??????? (1 ?? 1000 ??)

16
????????
????????? ?????????????? ???-????????? ????????? ?????????????? ???-????????? ????????? ?????????????? ???-????????? ????????? ?????????????? ???-????????? ????????? ?????????????? ???-?????????
?????????? ????? ????????? ??? 95? (min) ?????????????? ?????????? 5'-3' (/-) ?????????????? ?????????? 3'-5' (/-) ????????? 3'-??????
Taq 40 - ?-??
Tth 20 - A-??
Pfu 120 - blunt ends
Vent 400 - blunt ends
Deep Vent 1300 - blunt ends
UlTma 50 - blunt ends
Pwo 120 ??? 100? - blunt ends
17
????????

• ????? ????????? 18-30 ???????????
• GC-?????? 45-55, ?????? ? GC-??????? ???????
• ??????? ? ???????????? ?????? ?? ????? 5??
• ?? ?????? ??????????? ?????? ?? 3-?????
• ?? ?????? ??????????? ?????? ?? 3-??????

18
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• ????????????? ??????? ???????
• ????????? ??????? ???????
• ?????? ??????????? ?????
• ????. ????? ??????
• ????. ?????????
• ????. ??????????
• ??????? (????????, ????, ????????, ??? ? ??.)

19
?????? ??????????? ??????
?????? ???????????? ????? ??????
20
10 ??????, ?? ??????? ??? ????? ?? ????

• ?????? ?????? ?????????
• ???????? ???????????? ?????????
• ??????? ????? dNTP ??? ??????????????? dNTP
• ?? ???????????? ??????? MgCl2
• ???????? ???????????? MgCl2
• ??????? ???????????
• ?????? ???????? ???????????? ?????
• ??????? ????? ????????
• ?????? ? ????????? ?????????????
• ?????????? ??? ??????? ???????

21
?????? ??????????? ???????

• ????????????
• ???????????? ? ???????

22
????????????? ???

• ??? ? ??????? ??????? (hot-start PCR)
• Touchdown
• ??????????????
• ????????? (nested)
• In situ PCR
• Reverse transcriptase (RT-PCR)
• Real-time PCR (RT-PCR)

23
?????? ?????? ????????????

• ???????? ?????? ??????? (???, LCR)
• NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)

24
??????????? ???????????????? ????????

• ????????????
• ??????????? ??????????? (??????? ????) ??
  ???????? ????????????? ??????? ???
• ?????????? ????????????? ???????????? ?
  ??????????????? ??? ?????? ? ??????? ?????????? ?
  ??????????, ??????????? ??? ??? ???????? ???
• ???????????? ?????????? ? ?????? ????????????
  ?????????????? ? ?????????????? ?????????
• ???????? ???????? ????????? ?? ???????? ?
  ???????????? ????????

25
Real-time PCR

• ??????????????? ?????????
• SYBR green
• ???????????????? ?????
• Taqman
• Molecular beacons
• FRET probes

26
(No Transcript)