Pr

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La PCR quantitative en temps réel
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• Sommaire
• Présentation générale principes de la PCR en
  temps réel
• Démarche et exemples de résultat
• Exploitation des résultats technique de la
  gamme et
• du 2-DDCt

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• Sommaire
• Présentation générale principes de la PCR en
  temps réel
• Démarche et exemples de résultat
• Exploitation des résultats technique de la
  gamme et
• du 2-DDCt

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PCR en temps réel,  Quantitative PCR ,  Real
time PCR ,  Kinetic PCR ,  Real time RT PCR 
(sur ADNc),  FRET PCR  (Förster resonance
energy transfer )

• Formation du produit PCR suivie au cours du
  temps via lémission de fluorescence in situ
  (nombreuses approches possibles cf. infra).
• Détermination du nombre de cycle à partir duquel
  le produit PCR est détectable nombre de cycle
  seuil  Cycle threshold  (ou  crossing
  point  Ct.
• Moment dapparition du signal seuil (Ct)
  dépendant de la quantité de matrice initialement
  présente dans léchantillon amplifié.
  quantification de la matrice de départ et/ou
  calcul de ratios entre deux conditions

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Utilisée pour quantifier de - lADN génomique
par exemple, détection/quantification de
microorganismes dans un tissu (qql pg/µl - mais
attention, la présence dADN ne permet pas de
conclure quant à la viabilité de lorganisme
détecté). - ou des ADNc produits à partir des
ARNm après réverse transcription
détermination/comparaison du niveau
dexpression de certains gènes. Aussi utilisée
pour mettre en évidence de mutations ponctuelles
(homo/hétérozygotie, résistance aux antibiotiques
dans des gènes) à laide de sondes taqman très
spécifiques ou linterprétation des courbes de
fusion, par exemple.
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Principales techniques de la fluorescence au
cours de la PCR
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Principe de la détection des produits PCR par
émission de fluorescence par un agent intercalant
TaqMan Principe de la détection des produits PCR
par libération de fluorescence lors de la
dégradation dune sonde de type TaqMan
Le SybrGreen est un fluorophore sintercalant
dans le petit sillon de lADNdb
FRET Principe de la détection des produits PCR
par fluorescence lors dun transfert dénergie
par résonance (FRET) lors de lhybridation de 2
sondes sur leur séquence cible conduisant à un
rapprochement des fluorophores
QuantiProbe Principe de la détection des
produits PCR par libération de fluorescence par
dénaturation dune sonde lors de son hybridation
sur sa séquence cible
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• Lecture de la fluorescence
• Après lélongation SYBRGreen, technique
  Taqman
• A létape dhybridation Molecular Beacons,
  LightCycler hybridization probes

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Nature des fluorochromes reporters - FAM
bleu - VIC vert - NED noir - PET rouge
Meilleur quenching
Avantages de la Q-PCR avec sondes - très
spécifique (car cette PCR nécessite lutilisation
de deux amorces et dune ou plusieurs sondes
spécifiques) - possibilité de faire des
multiplexes i.e. plusieurs PCR dans le même tube
détection de fluorochromes différents
indicateurs de PCR différentes dans le même tube
Þ quantification relative directe, meilleure
normalisation.
Limites coût des sondes (surtout si nombreux
gènes différents à quantifier)
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• Limite de la technique SYBER-green risque de
  détection des dimères doligonucléotides ou dun
  produit PCR non spécifique
• contrôle lors de la mise au point par dépôt sur
  gel de la présence dune seule bande
• contrôle à chaque réaction de la présence dun
  seul produit PCR par évaluation du Tm du produit
  PCR à laide de la courbe de fusion (contrôle
  quil ny a bien quun seul produit, avec le bon
  Tm)

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Remarque Différence entre la PCR quantitative
et la PCR semi-quantitative La PCR
semi-quantitative est une PCR après laquelle
(technique en point final) la quantité de produit
est quantifiée sur gel. En parallèle, est
effectué un témoin positif (standard)
damplification dont la quantité est inchangée
dans les différentes conditions comparées. La
PCR quantitative repose sur la mesure continue
dune libération de fluorescence au cours des
cycles de PCR reflétant laccumulation de produit
PCR. Laspect quantitatif réside dans la
détermination du Ct ( cycle threshold  ou
 crossing point ) qui correspond au nombre de
cycles minimum nécessaire pour que la
fluorescence dépasse le seuil (fixé au dessus du
bruit de fond début de phase exponentielle
damplification).
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• Sommaire
• Présentation générale principes de la PCR en
  temps réel
• Démarche et exemples de résultat (en SybrGreenI)
• Exploitation des résultats technique de la
  gamme et
• du 2-DDCt

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Exemple de protocole de PCR en temps réel
Programme Dénaturation 95C
10 Amplification 45X (95C 10, 60C 10,
72C 10) Cooling 40C 30
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Spécificité des amorces
Vérification sur gel que les amorces namplifient
bien quune bande
10 ng
eau
5 ng
0,5 ng
1 ng
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  temps réel
• Démarche et exemples de résultat (en SybrGreenI)
• Exploitation des résultats technique de la
  gamme et
• du 2-DDCt

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(No Transcript)
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Technique des 2-(DDCt)
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Illustration de la formule
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Exemple
AmiF
RpoB
CtpH7 16,0 (0,1)
CtpH7 23,6 (0,2)
CtpH5 21,3 (0,1)
CtpH5 16,2 (0,1)
Ratio du nombre de transcrits amiF après une
croissance à pH5/pH7 2-(21,3-16,2)-(23,6-16,0)
5,6