PERSPECTIVES D

1
PERSPECTIVES DAMELIORATION POUR LA PRISE EN
CHARGE DE LA FEMME RHD NEGATIVE
2
INTRODUCTION INCOMPATIBILITES
RHDFOETO-MATERNELLES EN FRANCE
INCIDENCE estimée (pour 1000 naissances) MORTALITE estimée MORBIDITE SEVERE
1966 5 à 6 12 des cas
Prévention Rh ciblée Baisse de lindice de fécondité Dépistage biologique Médecine néonatale Échographie fœtale Transfusions fœtales IV
2006 0,8 4 des cas
3
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Efficacité
Taux cumulés d immunisation anti-D en fin de
grossesses chez la femme Rh négatif

• Spontané

• Après Ig Rh post partum seulement

• Ig Rh ante partum systématique

Nº1 Nº2 Nº3 Nº4
Rang de grossesse
4
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Le Principe Actif

• Basée sur lutilisation dimmunoglobulines
  polyclonales anti-D (IgRh)
• Seule source fractionnement de plasma humain,
  contenant un titre élevé danticorps dirigés
  contre lantigène RhD
• Plasma humain fourni par des donneurs RH-,
  hyperimmunisés par injections répétées de
  globules rouges RH(rémunérés)
• 97 de plasmas collectés aux Etats-Unis
• Spécialité commercialisée en France
• RHOPHYLACR (LFB laboratoire Français du
  fractionnement et des Biotechnologies)

5
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Mécanismes possibles
3 MECANISMES POSSIBLES Tous dépendent de la
formation dun Immun-complexe
I- Masquage des épitopes RhD par saturation des
sites antigéniques RhD.
III- Destruction antigénique par clairance
macrophagique très rapide des globules rouges RhD
IgG anti-D
Antigène RhD
II- Inhibition des lymphocytes B spécifiques par
interaction entre le RFcgIIb lymphocytaire et le
segment Fc des IgG anti-D.
6
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Inconvénients

• Médicaments dérivés du sang
• - Mesures maximales en matière de sécurité
  virale et autres agents infectieux (pour octroi
  dAMM par Afssaps) néanmoins toujours
  possibilité de transmission dagents non
  répertoriés
• - Règles de traçabilité
• - Information systématique des patientes
  concernant un médicament dérivé du sang (nature
  des produits utilisés, risques liés à leur
  utilisation, mesures de sécurité prises pour la
  fabrication des produits)
• Liés au mode de préparation de ces Ig anti-D
• Problème dapprovisionnement en plasmas
  hyperimmuns
• Problème dordre éthique liés à limmunisation de
  sujets volontaires sains

7
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives

Actuellement limmunoprophylaxie RH ante-natale
concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40
dentre elles portent un enfant RH-
1- Ig MONOCLONALES
8
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production dIg
MONOCLONALES

• Transformation de lymphocytes humains par lEBV

Ac
1
clonage
sélection
EBV
Ac
2
lymphocytes B transformés
cellules mononucléées

lignées B
Anticorps monoclonaux humains

• Biologie moléculaire Ac Mo humains
  recombinants
• Souris humanisées greffe des loci IgG humains

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IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production dAnti-D
recombinants
PRINCIPE
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IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig
MONOCLONALES

1- AFFINITE pour lantigène RhD (rendement de
fixation, saturation des épitopes)
CANDIDAT IDEAL
2-SPECIFICITE pas de réaction croisée avec une
autre cible antigénique
3- SENSIBILITE reconnaissance dun maximum de
variant
4- PHARMACOCINETIQUE équivalent à une IgG
polyclonale
5- FORT POTENTIEL dactivation des récepteurs Fcg
Importance de la glycosylation
post-traductionnelle
11

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig
MONOCLONALES

TESTS FONCTIONNELS Pour mesurer la fixation des
IgG anti-D aux différents récepteurs Fc Mesure
ADCC (antibody/dependent/cellular/cytotoxicity),
permet la mesure des interactions avec le
récepteur FcgRIIIa
Fc
RI
g
Fc
RII
IgG
g
Lymphocyte
Ac
Lyse
Fc
RIII
Ag
g
12
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Test de clairance des
hématies
10 mg
IgG polyclonales Volontaire RhD- injection de 1,5
ml de GR RhD marqués au Cr51 Injection de 10 mg
de poly D H0 Injection de 100 mg de poly D
H50 T1/2 18h pour 10 mg T1/2 3h pour 100 mg
100 mg
IgG monoclonales Volontaire RhD- injection de 1,3
ml de GR RhD marqués au Cr51 Injection de 871 mg
de MONO-D T1/2 13,7 jours
Etude Yves Brossard CNRHP
13
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS 1ers anticorps
Test de survie des GRs
(1996)
AD1AD3
Poly-D n4 AD1AD3 n8
Etude clinique sujets Rh-, hématies Rh Cr51,
Ig polyclonale anti-D WinRh0, Ac monoclonaux
humains AD1AD3 (VV)
AD1AD3 mAbs
Poly-D
Time
AD1AD3 clairance moins rapide et incomplète
par rapport à celle obtenue avec les Ig
polyclonales anti-D
14
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Clairance des GRs
marqués au 51Cr

• R297 anticorps monoclonal du LFB
• Excellente clairance en comparaison avec un
  anti-D polyclonal

I.V. injection of autologous 51Cr RhD RBC into
male volunteers - 51Cr RBC only, n2 -
51Cr RBC 25 saturation with marketed Poly-D
antibodies , n7 - 51Cr RBC 25 saturation
with Emabling R297 anti-RhD mAb , n7
Marketed poly-D
15
IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES
Plusieurs anticorps monoclonaux sont en cours de
développement et ont été évalués en clinique -
Rheseclone Russie , produit par une lignée
lymphoblastoïde EBV, aucune donnée disponible -
BRAD-3 (IgG3) et BRAD-5 (IgG1) Royaume Uni par
BPL (Bioproduct Labratories) seuls ou en
association capable dinduire une
immunosupression chez des sujets RhD- ayant reçu
des GR RhD, mais clairance des hématies moins
rapide que les Ig polyclonales - MonoRh0
Suisse, ZLB-CSL testé chez volontaire Rh
négatif immunosupression bien clairance
dhématies RhD injecté beaucoup plus faible
quavec le RhophylacR - R597 France, LFB,
sélection d un anticorps humain monoclonal
recombinant sur la base de son activité
fonctionnelle Forte liaison aux récepteurs
FcgRIII, activation des cellules NK avec lyse des
hématies RhD, clairance dhématies RhD aussi
rapide que RhophylacR

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IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES

• INCONVENIENTS
• Problème des résistances éventuelles
  développement danti-idiotype
• Pour prouver efficacité et pour envisager de
  remplacer les IgG polyclonales besoin dune
  évaluation à grande échelle

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IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives

Actuellement limmunoprophylaxie RH ante-natale
concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40
dentre elles portent un enfant RH-
2- GENOTYPAGE
18
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE COMPLEXE Rh

Protéine RHD protéine transmembranaire du
Globule Rouge 15000 sites par GR RhD
19
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LA PROTEINE RHD

20
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE LOCUS
RH

Isolement et séquençage du gène RHD par léquipe
française INSERM U76, Y. Colin et al. Genetic
Basis of the RhD-Positive and RhD-Negative Blood
Group Polymorphism as determined by Southern
Analysis . Blood 1991 28 2747-52
21
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL Liquide amniotique -
Plasma

I - Génotypage RHD fœtal réalisable sur lADN des
cellules amniotiques (année 90) P.R. BENNET et
al. N.eng.J.Med. 1993 329607-610 J.T. AUBIN et
al. Br J Haematol 1997 98 (2) 356-364. -
Diagnostic invasif II Génotype RHD fœtal à
partir du sang des femmes enceintes RhD Suite à
la découverte de la présence dADN fœtal dans le
plasma des femmes enceintes ( 1 à 6 dADN
dorigine fœtale sous forme acellulaire) LO Y.M.
et al. Am J Hum Genet, 1998, 62 768-775. -
Diagnostic non invasif Limite du test femme ne
doit pas posséder dans leur génome des séquences
non exprimées du gène RHD.
22
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL ADN
fœtal dans le plasma maternel

Persistance in vivo Demi-vie lt 1 heure
Isolement Rapide, simple
Quantité de Génomes (par ml de plasma
maternel) 25 (3 à 70) à 15 S.A. 290 (77 à 769) à
terme
ADN fœtal dans le plasma
23
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL
INTERET
I- GROSSESSES AVEC IMMUNISATION
ANTI-D Diagnostic dIncompatibilité
foeto-maternelle RhD (environ 1000 cas / an en
France avec 90 de fœtus Rh) II- GROSSESSES
SANS IMMUNISATION ANTI-D Cibler
limmunoprophylaxie Rh anténatale et les RAI
itératives aux seules femmes Rh - avec fœtus Rh
(environ 120.000 femmes / an en France avec 65
de fœtus RH)

Validation du génotypage non invasif par une
étude portant sur 851 femmes enceintes au
CNRHP C. Rouillac-Le Sciellour et all Large scale
Pre-Diagnosis study of Fetal RHD Genotyping by
PCR on plasma DNA from RhD-negative Pregnant
women. Mol Diagn 2004 8 23-31.
24
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN
PRATIQUE

• Sang maternel collecté sur EDTA ( 5 à 7 ml), 48h
  max entre prélèvement et réception au laboratoire
• Centrifugation puis décantation plasma
• Extraction de lADN plasmatique
• Amplification par PCR des séquences spécifiques
  du gène RHD
• - exon 7 ( plus spécifique mais moins
  sensible)
• - exon 10 (plus sensible mais moins
  spécifique)
• Les 2 amplifications distinctes permettant
  daugmenter la sensibilité du test et détecter un
  maximum de variant du système RH
• SI FŒTUS RH- REPETER LE TEST SUR UN SECOND
  PRELEVEMENT
• Concentration plus élevée dADN fœtal
• 2) Rattraper une erreur détiquetage
• 3) Rattraper un croisement per-analytique des
  échantillons

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LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL
EVOLUTION
Coopération RECHERCHE INDUSTRIE (INSERM INTS-
CNRHP - J.BOY) Trousse développée en
2006-2007 Kit de 1ère génération pour PCR en
Temps Réel avec reporter fluorescent.Marquage CE
obtenu en JUIN 2007 Cibles exons X et
VII (amorces CNRHP)Sonde Taqman Projet STIC
2007-2008 Génotypage RHD fœtal non invasif
systématique Paris-CNRHP / Marseille / Lille /
Poissy / Nantes  OBJECTIFS MEDICO-ECONOMIQUES
-Diminution des injections inutiles dIgRH et
des RAI chez les femmes avec fœtus Rh négatif
? - Amélioration de la compliance à la
prévention Rh anténatale, ciblée ou systématique
chez les femmes avec fœtus Rh positif ? -
Evaluer la faisabilité et le coût dun programme
de Génotypage fœtal RH systématique dans le cadre
actuel du suivi prénatal en France.


26
LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL
REGLEMENTATION

• Depuis le décret 1661 du 22 décembre 2006 le
  génotypage fœtal RHD peut être effectué
  uniquement
• Dans un laboratoire autorisé par lAgence
  Régionale dHospitalisation, après avis de
  lAgence de Biomédecine.
• Par des biologistes agrées par lAgence de
  Biomédecine.