Lutilisation de la PCR en clinique

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Lutilisation de la PCR en clinique

• DES Médecine Interne-Maladies Infectieuses
• Dr Hector Rodriguez-Villalobos
• Service de Microbiologie. Hôpital Erasme-ULB

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Définition et principe général

• Le principe de cette technique fait appel à 3
  éléments
• Un ADN bicat chauffé au-dessus dune certain
  température se sépare
• Après chauffage le refroidissement permet une
  nouvelle hybridation entre séquences
  complémentaires
• Les ADN polymérases sont des enzymes capables de
  recopier un brin dADN en sappuyant sur un
  fragment complémentaire préalablement hybridé

http//www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/
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PCR Principe et conditions

• Imaginée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel dès
  1993),
• Essor considérable à partir de la
  commercialisation (vers 1988), d'une ADN
  polymérase résistante aux températures élevées
  (la Taq polymérase), qui permet une
  automatisation de la technique.
• Il s'agit de réaliser une succession de réactions
  de réplication d'une matrice double brin d'ADN.
• Chaque réaction met en oeuvre deux amorces
  oligonucléotidiques dont les extrémités 3
  pointent l'une vers l'autre. Les amorces ou
  primers en anglais définissent alors, en la
  bornant, la séquence à amplifier.
• L'astuce consiste à utiliser les produits de
  chaque étape de synthèse comme matrices pour les
  étapes suivantes, au lieu d'être linéaire,
  l'amplification obtenue est exponentielle.

http//www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/
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PCR "chercher une aiguille dans une meule de
foin" ?

• Abréviation de lexpression anglaise Polymerase
  Chain Reaction ou Réaction en Chaîne par
  Polymérase
• À partir dun échantillon complexe et peu
  abondant (par ex. une goutte de sang), la PCR
  permet multiplier spécifiquement le segment d'ADN
  d'intérêt (aussi appelé ADN cible)
• L'ordre de grandeur est du million de copies en
  quelques heures. (généralement suffisant pour une
  utilisation ultérieure).

http//www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/
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PCR Principe et conditions
http//www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/
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PCR Principe et conditions
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PCR Principe et conditionsPremier cycle
dénaturation
   
Séquence cible

•   A cette température, les liaisons faibles qui
  assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN
  sont rompues pour donner deux simples brins
  d'ADN.
•      

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PCR Principe et conditionsPremier cycle
Hybridation (annelage)

• L'hybridation des amorces sur l'ADN repose sur le
  principe de l'appariement des bases
  complémentaires.
• Le choix de la température d'hybridation est
  calculée en fonction de la longueur et de la
  séquence des amorces.
• La température d'hybridation est inférieure à la
  température de dénaturation.

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PCR Principe et conditionsPremier cycle
élongation

• Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de
  départ à la polymérisation du brin d'ADN
  complémentaire de l'ADN matrice.
• par ajout successif des désoxyribonucléotides
  (présents dans le mélange en large excès). Chaque
  base ajoutée est complémentaire de la base
  correspondante du brin matrice.
• La copie de l'ADN initial génère des copies plus
  longues que souhaité.

http//www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/
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Fin du cinquième cycle et cycles suivants..
ADN cible augmente de forme exponentielle

• A chaque fois, la quantité d'ADN double dans le
  tube.
• De façon théorique, en partant de 2 brins d'ADN
  initiaux
• on obtiens 4 segments d'ADN à la fin du premier
  cycle
• 8 à la fin du second, 16 à la fin du troisième
• et jusqu'à 2 à la puissance n après n cycles ...
• soit plus d'un million de copies en une vingtaine
  de cycles !
•  

http//www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/
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PCR Principe et conditions
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Détection et analyse du produit de réaction

• Analyse sur gel dagarose
• Détection par un système de type ELISA
• Séquençage directe
• DNA Microarrays (micro chips)
• Hybridation spécifique (Line probe assays LipAs)
• Real-time PCR

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Microarrays (Chips)
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(No Transcript)
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Types de PCR

• RT-PCR
• Utilisation dune  reverse transcryptase  avant
  de la PCR permet de détecter cibles ARN (RNA
  virus, RNA ribosomale, mRNA)
• Quantification de virus VIH et VHC  charge
  virale 
• Meningoencephalites par entérovirus
• Dengue, virus Hantan, SARS, metapneumovirus
• Bactériologie plus de corrélation de mRNA avec
  la présence dorganismes viables
• NASBA et TMA

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Types de PCR

• PCR- MULTIPLEX
• Utilisation de plusieurs paires damorces dans la
  même réaction
• Permet de détecter plusieurs cibles (pathogènes)
  dans une réaction
• Inconvénients interaction entre différents
  amorces, compromis de sensibilité, design
  difficile)
• Utilité détection de agents viraux respiratoires
  ou chez la méningite, ou bactériens producteurs
  de pneumonies atypique
• NESTED-PCR
• Augmente la sensibilité avec 2 sets damorces
  dirigés contra la même cible (le 2ème paire
  damorces est utilisé en une 2ème réaction sur le
  produit damplification)
• Très sensible mais beaucoup de risques de
  contamination.

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PCR en temps reel

• Sondes fluorescents (haute spécificité pour la
  séquence cible)
• Pas besoin de manipulation du produit post-PCR
• Prévient les contaminations potentielles.
• Plus rapide. quantitative (beaucoup plus précise
  et moins laborieuse)

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Automatisation

• 3 étapes techniques traitement de léchantillon,
  amplification acide nucléique et détection du
  produit.
• Automatisation de lextraction et purification de
  lADN
• Automate pour lamplification et détection
•  fully-automated systems 
• Screening HIV-1 et VHC (jusquà 500 test en 8
  heures)
• Détection des germes responsables des sepsis avec
  marqueurs de résistance (MRSA, MSSA, BGN, Levures)

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PCR en temps reel
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Applications de la PCR

• Étude phylogénétique (16S rDNA).
• Application aux études épidémiologiques, domaine
  de lhyène hospitalière
• (recherche de pathogènes dans leau ou
  environnement)
• Diagnostique
• Détection dorganismes non-cultivables,
  fastidieux ou de croissance lente directement sur
  léchantillon (Legionella, Mycobacterium,
  champignons)
• Détection dorganismes présents en très faible
  quantités.
• dans le cas ou revêt un caractère durgence
  (méningite)
• Détection de virus RNA
• Mesure de la réponse génétique (mRNA) des
  organismes à différents stimulations
• Recherche déléments génétiques dintérêt,
  variabilité et expression de gènes.

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Applications de la PCRDétection dorganismes
non-cultivables ou de croissance lente

• Pour certains maladies la PCR a remplacé la
  culture comme étant le  gold standard 
• Hépatite C, méningite entérovirus, coqueluche,
  encéphalite par herpes simplex, MST par C.
  trachomatis
• Bonne performance pour détecter organismes
  fastidieux
• N. gonorrhoeae
• Plus grand impact en virologie clinique
• plus rapide, sensibles et meilleur rapport
  coût-bénéfice que les méthodes traditionnelles
• la sensibilité antivirale nest pas
  systématiquement testée.
• Découverte de nouveaux agents pathogènes HCV,
  Tropheryma Whippelii

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Applications de la PCRIdentification des
bactéries et champignons

• Séquençage du gène 16S rRNA
• Relations phylogénétiques
• Nouveaux standard pour lidentification
• rapide et donne des informations précises
  indépendamment des caractéristiques phénotypiques
• Désavantages coût, absence de software
  danalyse, bases de donnés limités
• kits commerciaux pour séquençage du ribosome

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Applications de la PCRPrédire la progression et
prise en charge des maladies

• Charge virale de VIH-1
• A montré en 1996, risque de progression et mort
  directement lié à la charge virale plasmatique
• Typage viral
• VRS du type A, pire pronostique chez les enfants
• HPV du type 16 et 18 haute risque de progression
  au cancer du col. Types 6 et 11 faible risque.
• UTILITE DANS LA PRIS EN CHARGE
• Charge virale du CMV
• Utile pour débuter une thérapie  pre-emptive 
  chez les greffes dorganes solides et
  différencier maladie active dinfection latente
• Possible rôle des techniques quantitatives chez
  autres herpes virus (EBV, HV6)

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Applications de la PCRUtilité dans la réponse au
traitement

• Détection des gènes de la résistance aux
  antibiotiques
• pouvoir supérieur que les méthodes phénotypiques.
  MRSA, VRE, M.tuberculosis RIF-R.
• Néanmoins méthodes classiques restent encore
  privilégies en termes de coût et information
• Rôle dans le monitoring de la réponse aux
  traitements antiviraux
• Charge virale et génotype
• Facteurs indépendamment prédictifs de la réponse
  à la ribavirine et interféron chez les patients
  avec hépatite C chronique (gt 2 millions copies/mL
  ou génotype 1 pire réponse).
• Paramètres aussi utilisés pour déterminer la duré
  du tt
• Quantification de HIV-1RNA guide pour débuter,
  suivie et changer la thérapie antiretrovirale
• Détection des mutations responsables de la
  résistance utiles pour optimiser le traitement
• Charge virale VHB et VHC dans linfection
  chronique
• Persistance de CMV après plusieurs semaines de tt
  associé à la résistance

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Applications de la PCRPrincipaux inconvénients

• Contaminations
• Détection des produits damplification lente et
  laborieuse  réservé pour les pathogènes
  principaux 
• Plate-forme de PCR automatisés ou
  semi-automatises rendent la technique plus
  facile.
• Validation des résultats Discrimination dun
  porteur versus malade, rôle de lADN circulant ?
• Disponibilité et Prix
• Elle ne possède pas pour le moment le caractère
  polyvalent dune mise en culture classique

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Applications de la PCRTypage moléculaire des
pathogènes nosocomiaux

• Typage de souches isolées déchantillons
  cliniques
• Déterminer lextension de la diffusion clonale
• Identifier les sources de contamination
• Vérifier le mode hypothétique de transmission
• COMPLEMENT DE LENQUETE EPIDEMIOLOGIQUE REALISEE
  PAR LEQUIPE DHYGIENE HOSPITALIER

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Applications de la PCRTypage moléculaire des
pathogènes nosocomiaux

• Individu
• Confirmation dune infection par un germe
  opportuniste à partir dun réservoir
• Établir le foyer initial et lextension dune
  infection
• Distinguer entre une rechute et une réinfection
• Investigation dépidémies
• Confirmation de la transmission
• Origine de transmission et réservoir
• Suivre lévolution du réservoir
• Mesurer lefficacité des stratégies de maîtrise
  des infections
• Programmes de surveillance
• Local, régional, national ou international
• Évolution et dissémination de  types 
  épidémiques
• Alerte nouveau  type 

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AFLP typing of Legionella pneumophila serogroup
1 Comparison of Outbreak Cases, Water Outlets
and Controls


cases
water
Block A
Unrelated control patients
Block B water
1
2


M
M
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Quelques exemples de lutilité de la PCR en
bactériologie

• Détection et ID directe de lespèce dans des
  échantillons cliniques stériles (LCR, sang,
  tissus, liquide synovial) en utilisant des
  amorces spécifiques ou universelles
• Organismes à croissance lente ou non-cultivables
• Dans des échantillons culture-négatifs provenant
  de patients sous thérapie antimicrobienne
• Endocardites, arthrites, ostéomyélites, méningites

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Quelques exemples de lutilité de la PCR en
bactériologie

• Legionella
• Pneumonie acquise dans la communauté ou
  nosocomiale (RX) chez patient à risque
  (immuno-dépression, voyage, contexte épidémique),
  pneumonie sévère (USI)

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Quelques exemples de lutilité de la PCR en
bactériologie
indications selon CDM  http//www.uia.ac.be/cmd/
32
Quelques exemples de lutilité de la PCR en
bactériologie

• Bartonella henselae et B. quintana
• Confirmation de maladie des griffes du chat
  (aspiration ou BX ganglionnaires)
• Confirmation dangiomatose bacillaire (biopsie
  cutanée)
• Borrelia burgdorferi
• Confirmation de neuroborreliose ou mise au point
  dinfection chronique du SNC (LCR)
• Arthrite aseptique ou chronique ou récurrente
  (Liq synovial)
• Confirmation dérythème migrant en cas de
  présentation atypique et sérologie négative (BX
  cutanée)
• Évaluation du suivi thérapeutique

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Quelques exemples de lutilité de la PCR en
bactériologie

• Chlamydia pneumoniae et Mycoplasma pneumoniae
• Enfants ou adultes présentant une toux
  persistante depuis au mois 14 jours
• Pneumonie acquise dans la communauté documenté
  par RX et sans présomption dinfection par
  pneumocoques
• M. pneumoniae encéphalite, méningites avec LCR
  neg
• Bordetella pertussis
• Toux progressive avec épisodes de toux
  paroxysmale, reprise inspiratoire sifflante
   chant du coq , toux émétisante.
• gt18 ans toux progressive gt3 s sans maladie
  pulmonaire
• Recherche de contacts dans la famille ou
  linstitution
• Échantillon aspirations nasoph, sputum

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Recherche de gènes de toxines et de résistance
aux antibiotiques par PCR

• Recherche des gènes pour la toxine diphtérique
  (C. diphtheriae)
• Recherche dE. coli producteur de vérocytotoxines
  (VTEC).
• Patients souffrant de syndrome hémolytique-urémiqu
  e, de diarrhée sanglante ou impliqués dans une
  épidémie de diarrhée.
• Gènes de résistance chez les entérocoques
• Confirmation de R au glycopeptides (en cas de
  résultat phénotypique atypique) dans les cas de
• infection clinique, épidémies nosocomiales,
  admission dans un service à risque
• Confirmation du phenotype vanA, et vanB, de E.
  casseliflavus ou E. gallinarum (phenotype vanC)
  en cas d'infection clinique
• Détection de la résistance aux macrolides chez H.
  pylori (présence de mutations dans le gène du
  rRNA 23S)
• Sur biopsie gastrique ou de mucus gastrique
  obtenus par endoscopie (en cas dinfection
  persistante après un traitement antibiotique
  incluant des macrolides).
• A partir dune culture en cas de résultat douteux
  de lantibiogramme.

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Recherche de gènes de toxines et de résistance
aux antibiotiques par PCR

• Indications de la détection par PCR de la
  résistance des staphylocoques à la méticilline ou
  mupirocine(PCR mecA, mupA, mec-nuc, mec-femA)
• Souches de staphylocoques confirmation de la
  résistance à la méticilline et/ou identification
  de S. aureus (multiplex PCR)
• Souches de S. aureus résistantes à la mupirocine
  
• confirmation de haut niveau de résistance (CMI
  gt256 µg mupirocin /ml) par détection du gène mupA
  par PCR

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Indications pour lapplication de techniques
damplification moléculaire pour la détection de
Hépatite B

• dosage quantitatif dADN
• Indications
• instauration dun traitement chez un malade
  chroniquement HBsAg positif ou HBe Ag positif, ou
  HBe Ag négatif (mutants précore possibles).
• suivi dun traitement dhépatite B chronique
• poussée aiguë dhépatite B chronique
• Conditions
• tests hépatiques perturbés, particulièrement
  lALT
• maximum deux fois par an et par patient
• Échantillonnage
• léchantillon de sang, prélevée spécifiquement
  pour ce test (éviter la récupération de sang
  après dautres tests à cause du risque de
  contamination)
• sérum tube sec, centrifugation dans le
  laboratoire local et envoi comme sérum conservé
  au frais
• plasma sang sur EDTA (jamais dhéparine),
  centrifugation dans le laboratoire local et envoi
  comme plasma conservé au frais.
• détection qualitative de lADN
• Ce test peut être utile lors dincertitude
  concernant lexistence dune infection par
  exemple anti-HBc isolée ou hépatite chronique
  séronégative

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Détection du virus Varicella Zoster

• Malades présentant des symptômes neurologiques
  encéphalite, méningo-encéphalite, méningite,
  myélite.
• Malades présentant certaines affections
  ophthalmologiques, kératite, uvéite, rétinite
  aigue

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PCR HIV-1 ADN

• Principe de la méthode
• Cette PCR amplifie 3 régions différentes de lADN
  proviral du HIV-1 situées dans les gènes pol env
  et ltr.
• LADN proviral est amplifié par une nested PCR
  (PCR nichée ou emboitée) et les amplicons sont
  détectés par marquage au bromure déthidium et
  électrophorèse.
• Application
• Diagnostic de linfection chez des bébés nés de
  mère séropositive
• Diagnostic de linfection chez des patients à
  risque ayant un test de confirmation indéterminé
• Diagnostic de linfection chez des patients
  immunodéprimés (déficit commun variable,)

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Charge virale HIV - Kit COBAS HIV-1 Amplicor,

• Surveillance du patient séropositif pour le
  HIV-1.
• Types déchantillon
• Plasma prélevé sur EDTA de préférence,
  éventuellement sur citrate. Jamais de plasma
  hépariné !
•  Principe de la méthode (kit COBAS amplicor HIV-1
  monitor)
• La mesure de la charge virale se fait en
  quantifiant le nombre de molécules dARN viral,
  sachant quun virion contient 2 molécules dARN.
• Le test Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 est basé sur
  5 étapes majeures 
• la préparation de léchantillon,
• la transcription inverse de lARN cible pour
  générer lADN complémentaire (ADNc),
• lamplification par PCR de lADNc à laide
  damorces spécifiques du HIV-1,
• lhybridation de lADN amplifié avec des sondes
  oligonucléotidiques spécifiques,
• et la détection des sondes hybridées avec lADN
  amplifié grâce à une réaction colorimétrique.
• Le test Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 permet la
  transcription inverse et lamplification du HIV-1
  et dun Standard de Quantification (QS). Le
  mélange réactionnel contient une paire damorces
  biotinylées spécifiques des acides nucléiques
  cibles du HIV-1 et de celui du QS.
• La quantité dARN du HIV-1 est déterminée à
  laide du standard de quantification (QS).

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Détection de Polyomavirus JC et BK

• DX de PML (progressive multifocal encephalopathy)
  sur LCR ou biopsie du cerveau
• DX (urines) de cystite hémorragique tardive et
  prolongée
• chez des transplantés de moelle osseuse
• chez des patients traités pour une leucémie
  lymphoblastique aiguë réfractaire.
• Dautres indications
• néphrite tubulo-interstitielle chez des patients
  ayant subi une allogreffe de rein
• rétinite atypique chez les patients en
  immunosuppression.

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• Entérovirus
• Présomption de méningite virale ou de
  méningo-encéphalite. Échantillon LCR
• Péricardite et/ou myocardite aiguë. Échantillon
  liquide péricardique, sang sur EDTA, biopsie
  myocardique ou péricardique
• Diagnostic prénatal de linfection congénitale
• mort ftale ou retard de croissance ftale,
  hydro-, oligo-amnios, épanchement pleural ou
  péricardique, hyperechogenicité abdominale,
  calcifications abdominales
• Échantillon sang ftal sur EDTA, liquide
  amniotique
• Rubéole
• Diagnostic prénatal de rubéole congénitale
• Patientes avec une séroconversion avant la 16 ème
  semaine de grossesse..
• Début de la grossesse avec un profil sérologique
  sur la base duquel il est difficile de déterminer
  si linfection a eu lieu juste avant ou après la
  conception..
• La PCR peut être effectuée sur le liquide
  amniotique.
• Une PCR négative nexclut pas une infection
  congénitale

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• Detection du parvovirus B-19
• Diagnostic de linfection congénitale, en cas
  danomalies échographiques évocatrices
• Crise danémie aplasique
• Arthropathie
• Aplasie de la lignée rouge ou pancytopénie chez
  les patients immunodéficients
• Échantillon serum (minimum 1 ml) et
  éventuellement    liquide amniotique ou sang
  fétal si prénatal    moelle osseuse en cas d
  immunodéficience    liquide synovial en cas d
  arthropathie
• détection du Human papillomavirus (HPV)
• Diagnostic cytopathologique répété de ASCUS
  (atypical squamous cells of undetermined
  significance) ou AGUS (atypical glandular cells
  of undetermined significance).
• Diagnostic répété de LSIL (low-grade squamous
  intra-epthelial lesions)
• Contrôle post-opératoire de maladie HPV
  résiduelle
• détection du virus Herpes Simplex (HSV1 - HSV2)
• Malades neurologiques encéphalite,
  méningo-encéphalite, méningite, myélite.
• affections ophthalmologiques, kératite, uvéite,
  rétinite aiguë
• Herpes du nouveau né
• Malades immunodéprimés avec atteintes
  oesophagiennes ou intestinales observées de visu

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Indications pour lapplication de techniques
damplification moléculaire pour la détection de
l'infection à cytomégalovirus

• Patients immunocompromis
• Transplantés de moelle osseuse ou d'organes
  solides
• Patients VIH (lt 100 CD4/mm³)
• Patients traités par immunosuppresseurs
• Diagnostic de la maladie à CMV
• Symptômes Pneumonie, atteinte gastrointestinale,
  hépatite, atteinte du SNC, rétinite, syndrome à
  CMV (fièvre, leucopénie, thrombocytopénie ,
  perturbation des tests hépatiques).
• Échantillons LBA, LCR, humeurs aqueuse ou
  vitrée, biopsies tissulaires
• Surveillance des patients immunocompromis
• Patient séronégatif pour le CMV greffé avec un
  organe séropositif ou ayant reçu des
  transfusionsÉchantillon sang
• Diagnostic prénatal chez la femme enceinte à
  risque d'infection congénitale à CMV
• Infection primaire confirmée apparition d' IgG
  et/ou d' IgM chez une patiente habituellement
  séronegative.
• Suspicion d'infection primaire présence d' IgG
  et IgM lors de la première investigation
  sérologique prénatale, le statut sérologique
  antérieur à la grossesse étant inconnu. Lorsque
  la première investigation sérologique est
  réalisée au delà de 3 mois de grossesse, une
  infection primaire en cours de grossesse ne peut
  être exclue

44
Indications pour lapplication de techniques
damplification moléculaire pour la détection de
ARN du Virus Hepatitis C

• Détermination qualitative
• Diagnostic dune transmission verticale,
  infection dun nouveau-né dune mère HCV
  positive analyse du sang du nouveau-né à lâge
  de six mois
• détection dARN HCV chez des patients HCV
  positifs présentant des signes d hépatique
  chronique (transaminases dau moins 2 x avec un
  intervalle de six mois)
• confirmation dune infection HCV, même en cas de
  anti-HCV négatifs chez des patients
  immunodéprimés (dialyse rénale, VIH,
  médication,..)
• suivi dune thérapie
• IFN monotherapie après 3 mois, à la fin du
  traitement et 6 mois plus tard
• IFN ribavirine après 3 mois, à la fin du
  traitement et 6 mois plus tard
• Détermination quantitative
• Détermination de la charge virale avant le
  commencement dun traitement (la charge virale a
  une valeur pronostique et peut influencer le
  choix et la durée dune thérapie)
• Seconde détermination du viral load après 12
  semaines dans le cas d'un génotype 1 sous
  traitement.
• Genotypage
• Détermination du génotype avant le commencement
  dune thérapie (le génotype a une valeur
  pronostique et peut influencer le choix et la
  durée dune thérapie)
• Les PCR à usage diagnostique peuvent se faire sur
• Plasma EDTA, Serum, Biopsie hépatique

45
Détection et lidentification de human
herpesvirus type 8 (HHV8)

• Méthodes conventionnelles
• Sérologie relativement imprécise (nécessité
  dutiliser plusieurs tests)indication de contact
  avec le viruspas de relation directe avec les
  maladies associées
• Culture difficile, peu sensible 
• Indications cliniques
• Diagnostic des maladies associées à linfection
  HHV8Sarcôme de Kaposi  
• Classique, africain, iatrogène (immunosuppression,
  greffe), associé à lHIV, Maladie de Castleman,
  Primary effusion lymphoma
• Éventuellement monitoring dun traitement
• PrélèvementsBiopsies des lésions sensibilité
  100 (SK)Recherche dans sang périphérique
  sensibilité 50-60

46
Exemples dutilité de la PCR en ParasitologiePCR
real-time Toxoplasma gondii

• Cette PCR amplifie une région de lADN
  parasitaire située dans le gène B1.
• Lanalyse seffectue essentiellement dans les cas
  suivants
• ( indications selon CDM  http//www.uia.ac.be/cmd
  /)
• Diagnostic de la toxoplasmose congénitale ou de
  la suspicion de toxoplasmose congénitale
• Diagnostic de la toxoplasmose cérébrale chez les
  patients immunodéprimés
• Diagnostic des infections oculaires
• Les PCR à usage diagnostique peuvent se faire
  sur 
• Sang total, lymphocytes
• Liquides ( LCR, humeur aqueuse ou vitré )
• Biopsies
• Liquide amniotique
• Sang ftal
• Placenta

47
Utilité de la PCR en Mycologie
48
Détection dADN fongique
FUNGAL PCR
cible
49
Détection dADN fongique

• Lack of understanding of the kinetics of fungal
  DNA in infected patients
• At present its unknown how the fungal DNA is
  released from the site of infection and in which
  form it circulates in blood

50
P. jiroveciiContributions des méthodes
moléculaires

• Pouvoir diagnostique supérieur que la microscopie
  dans le sputum induit
• Effective pour le diagnostique de formes de
  pneumocystoses atypiques, dans les échantillons
  oropharangés et ANP chez les enfants
• Sensible et reproductible pour la détection de
  pneumocystis dans le LBA

51
P. jiroveciiContributions des méthodes
moléculaires Révision des concepts
épidémiologiques

• Meilleur connaissance de la taxonomie
• Démonstration de la bio-diversité
• Utile épidémiologique
• Réinfections gt réactivation
• 50 des cas de pneumonie récurrente ? souches
• Souches R (mutants DHFR) chez patients jamais
  traités
• Type génétique en relation avec la ville du
  prélèvement et pas avec la ville de naissance
• Transmission de la Pneumocystose
• Contamination par voi aérienne
• Détection de lADN dans laire
• Transmission horizontale
• Démontrée chez les animaux
• Transmission inter-humaine
• Proportion élevée dun génotype particulier
  transmis de patients HIV à transplantés dorganes

52

• problème dInterprétation des résultats
• Porteur? Maladie débutante?Malade?
• Organisme vivant? Organisme intact?
• Intérêt de la quantification

53
Nucleic acid detection in proven invasive
aspergillosis
SF Yeo and B Wong. Clin Microbiol Rev 2002
54
PCR in Candida fungemia or proven invasive
candidiasis
SF Yeo and B Wong. Clin Microbiol Rev 2002
VL Kan. JID 1993 JA Jordan JCM 1994 EB
Chryssanthou Scan JID 1994
JP Burnie EJCMID 1997 H Einsele JCM 1997 G Morace
JCM 1999
55
Real-Time PCR

• Interest in invasive candidiasis
• For identification 100 specific (M Guiver
  JCPathol 2001)
• Diagnostic tool
• quantification of yeast load in blood
• Detect 5 CFU/ml, gt96 reproducibility,S 100,
  SP 96.5
• (Y Maaroufi et al JCM 2003)
• Interest in Aspergillosis
• detects 5 CFU/ml, gt96 reproducibility, S 100
• (J Loeffler JCM 2000)

56
Modification of sensitivity by the incidence of
invasive aspergillosis

• The incidence of disease greatly influences the
  PPV and NPV of the assay
• Antigen detection appears to have better PPV at
  low incidence of disease compared with whole
  blood PCR
• The advantage of PCR is that a negative result
  always correlates with absence of disease

RR Klont et al CMI 2001
57
Nucleic acid detection in proven invasive
aspergillosis

• PCR positive preceding clinical evidence by a
  mean of 5.75 days (0-14 days)
• The role in monitoring response to the therapy is
  unclear
• Real-time PCR decrease the risk of false positive
  results

58
Conclusions

• PCR  maison  toujours présentes dans de
  nombreux laboratoires mais avec une tendance
  rapide vers lapparition de kits commerciaux et
  lautomatisation en améliorant la standardisation
  et la reproductibilité des résultats
• Nouvelle génération de termocycleurs et robots
  qui permettrant lapplication en routine
• la culture reste néanmoins le  gold standard 
  pour la plus part des germes
• Interprétation des résultats rester vigilant car
  de nombreux études sont encore nécessaires pour
  définir le seuil de positivité traduisant une
  signification pathologique