Presentazione di PowerPoint

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IMMUNOBLOTTING Pag. 322 par. 7.6
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Blocking molti siti di legame della membrana
(di nitrocellulosa o PVDF) rimangono liberi da
proteine dopo il trasferimento quindi si devono
bloccare questi siti con BSA o dry Milk (latte
in polvere) prima dellincubazione con anticorpi
La BSA e generalmente piu purificata del latte
in polvere ma contiene epitopi identici, quindi
ha meno capacità bloccante rispetto al latte Il
latte tuttavia non e raccomandato se si usano
anticorpi che riconoscono carboidrati.
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Il detergente non ionico Tween-20
(stringenza dell ibridazione) Il TWEEN nel
buffer di incubazione con lanticorpo serve per
interferire con il legame aspecifico
dellanticorpo alla membrana Un effetto
indesiderato e che il Tween interferisce anche
con il legame tra antigene e anticorpo e puo
causare la dissociazione delle proteine dal
filtro.
Quindi la concentrazione di Tween deve essere
attentamente calibrata e dipende dalla forza
dell interazione tra ligando e anticorpo
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• Immuno-blotting
• separazione del campione tramite PAGE
  (Poliacrilammide gel elettroforesi)
• Western blotting trasferimento delle proteine
  separate elettroforeticamente su membrana
• BLOCKING bloccaggio dei siti aspecifici
• Rivelazione con anticorpi primari (che
  riconoscono e legano recognize la proteina
  specifica di interesse) e secondari

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Perché nellimmunodetection si usa un anticorpo
secondario?
ed è coniugato con composti che ne permettono la
evidenziazione
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L anticorpo secondario può essere coniugato a
.
-fluorofori, - colloidi doro
-radioisotopi o, piu comunemente, ad un
enzima (es. Fosfatasi alcalina AF o perossidasi
di rafano HRP)
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ECL (Enhanced Chemioluminescence System)
Rivelazione
La perossidasi di rafano (HRP) in presenza di
perossido di idrogeno ossida il suo substrato,
il luminolo, con concomitante emissione di luce
10 volte piu sensibile di un metodo colorimetrico
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Colorazione delle proteine su carta
Ponceau S
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Colorazione delle proteine trasferite su carta
con Ponceau S
e un metodo rapido e reversibile di colorazione
delle proteine dopo trasferimento su carta. meno
sensibile del Comassie ma NON interferisce con
le procedure di immuno-detection
Ponceau S C22H12N4O13S4.Na4                      
                                
Ponceau S Staining Solution (0.1(w/v) Ponceau
S in 5(v/v) acetic acid)
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Es. Colorazione su membrana
Es. Colorazione su gel
ECL detection su membrana NC
Gel SDS-PAGE colorato con CBB
Sec4GFP
MW
1 2
Sec4
Membrana colorata con PonceauS
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Altri tipi di elettroforesi
One Dimensional (1D) Protein Electrophoresis
Separation Isoelectric focusing (IEF) (par
10.3.4)
2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1
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Isoelectric focusing (IEF)
IEF e un metodo per separare le proteine secondo
il loro punto isoelettrico
In un gradiente di pH e in presenza di un campo
elettrico le proteina migreranno fino a
raggiungere il punto nel gradiente dove la
loro carica e nulla Cioè al loro Punto
isoelettrico
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IEF impiega gel orizzontali su piastre di vetro o
fogli di plastica e percentuali di acrilammide e
agarasio che permettono la libera mobilità dela
molecole
Gli anfoliti coprono diversi di pH (es.pH 3-10 o
pH7-8) Il range di pH va scelto in dipendenza
dei pI delle proteine di interesse
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Isoelectric focusing of proteins (IEF)
Utile per separare proteine con differenti
modificazioni (es. Fosforilazioni) o isoenzimi
Creazione di un gradiente di pH usando anfoliti
http//www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp0091
9.nsf/Content/Elpho_IEFSeparation

• Nessun voltaggio applicato
• Gli anfoliti e le proteine si muovono quando
• la corrente e applicata secondo la loro carica
• C. Al pH isolelettrico le proteine sono focused
• cioè ferme

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PROTEOMICA
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L'elettroforesi bidimensionale (2D-Gels)
IDIEF. Le proteine vengono assorbite su
strisce di gel secchi che hanno gradienti di pH
immobilizzati. Una volta idratate e applicato il
campo elettrico le proteine acide che si trovano
sul lato alcalino del gel dissoceranno e saranno
caricate negativamente. A causa del campo
elettrico queste proteine migreranno al polo
positivo (il lato acido del gel).
.
2DSDS-PAGE
I E F
2D SDS-PAGE
Gel figure from http//www.microbiology.science.ru
.nl/tech/twod/
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Es. di uno strumento di Maldi-Tof in commercio
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Spettrometria di Massa MS-MALDI TOF
-Le molecole di campione sono convertite in ioni
gassosi -gli ioni sono poi accellerati in un
campo elettrico o magnatico o viene misurato il
TOF di ioni di massa diversa in una data distanza
- separati da unanalizzatore di massa-carica
(m/z) -il rivelatore detrmina il rapporto
massa/carica di ogni specie ionizzata
TOF
TOFTime of Flight Tempo impiegato da ioni di
massa diversa per percorrere un data distanza
MALDI-TOF (Ionizzazione per desorbimento laser
assistito da una matrice) Time of flight) mass
spectometer
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2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1
MALDI, spettrometria di massa TOF e
MALDI-TOF Pag.408-419 paragrafo 9.3.7
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Lelettroforesi capillare e usata per la
separazione analitica delle proteine, aminoacidi,
peptidi e frammenti di DNA
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TIPI di ELETTROFORESI CAPILLARE
CE Elettroforesi capillare,
CZE elettroforesi capillare in soluzione libera
HPCE elettroforesi capillare zonale
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Alto voltaggio (typicamente 10-30kV) capillare
sottile (25-100mm).
Le estremità del capillare sono immerse nel
serbatoi riempiti con lelettrolita. Gli
elettrodi sono fatti di platino e sono anche
inseriti nei serbatoi con lelettrolita. Il
campione (nanomoli) viene inniettato a una
estremità nel capillare. Generalmente un
rivelatore ad assorbanza UV si trova alla
estremità opposta del capillare.Il rivelatore
genera un grafico in funzione del tempo
Vantaggi nanolitri di campione sono sufficienti
e lanalisi è effettuata in tempo reale con alta
sensibilità (fentomoli 10-15)
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Tecniche cromatografiche Nella cromatografia si
definisce una fase mobile (liquida o gassosa
che fluisce sopra o attraversa una fase
stazionaria (un solido, un gel, un liquido o una
miscela solido liquido immobilizzata).
I composti che devono essere separati si devono
distribuire tra fase mobile e stazionaria in modo
che abbiano diversi coefficienti di distribuzione
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Cromatografia su colonna. La fase stazionaria è
attaccata ad una matrice (un supporto inerte e
insolubile) impaccata in una colonna la fase
mobile passa attraverso la colonna per gravità o
usando un sistema di pompaggio oppure un gas
sotto pressione.
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Caricamento del campione
Aggiunta del solvente
Colonna contenente la fase stazionaria
Recupero del campione
Schema di una semplice separazione in
cromatografia a fase liquida
La cromatografia a fase mobile liquida semplice
consiste di una colonna che tiene una fase
stazionaria nell'equilibrio con un solvente.
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• Le fasi stazionarie tipiche (e le loro
  interazioni con i soluti)
• sono

1. solidi (assorbimento Es. Silice QIAprep),
2. gruppi ionici su una resina (scambio ionico),
3. liquidi su un supporto solido inerte (di
   ripartizione ) e
4. particelle inerti porose (size-esclusion).

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Le molecole pi
ù
grandi del formato
Cromatografia di gel filtrazione
del poro non possono entrare nei pori
ed eluiscono insieme al primo picco
nel cromatogramma.
Le molecole che possono entrare nei
pori avranno un tempo di soggiorno
medio nelle particelle che dipende dal
formato e dimensione delle molecole.
Le molecole differenti quindi hanno
tempi totali differenti di transito
attraverso la colonna.
Le molecole che sono pi
ù
piccole di il
formato del poro pu
ò
entrare in tutti i pori
ed hanno il tempo massimo del soggiorno
sulla colonna e si eluiscono insieme come
l'ultimo picco nel cromatogramma. Questo
Campioni piccoli
ultimo picco nel cromatogramma
Campioni grandi
determina il limite totale di permeazione
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La cromatografia a fase liquida (LC) è una
tecnica cromatografica analitica che è utile per
la separazione gli ioni o di molecole dissolte in
un solvente.
La soluzione del campione rimane a luogo in
contatto con una seconda fase solida o liquida, i
soluti differenti interagiranno con l'altra fase
secondo le differenze nell'adsorbimento, scambio
ionico, dimensione o forma.
I componenti della miscela si separeranno usando
queste differenze ed esse determineranno il
periodo di transito dei soluti attraverso una
colonna
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La scelta tra fase mobile e stazionaria viene
fatta in modo che i composti da separare abbiano
diversi coefficienti di distribuzione Kd
Kd descrive il modo in cui un composto si
distribuisce tra due fasi immiscibili A e B a
temperatura costante. Kd (concentrazione
nella fase A/ concentrazione nella fase B)
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Capacità di ritenzione (K) è la quantità
totale di sostanza presente in una fase divisa
la quantità totale presente nell altra fase In
pratica Capacità di ritenzione K Kd .
VA/VB Kdcoefficiente di distribuzione
(concentrazione relativa dellanalita tra ledue
fasi) VAvolume del composto A VBvolume del
composto B
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• Tre diversi metodi di eluizione
• semplice o progressiva
• a stadi
• a gradiente di potere eluente.

• Eluizione semplice
• la fase mobile rimane la medesima durante tutta
  l'eluizione e le sostanze escono dalla colonna in
  dipendenza dai loro coefficienti di ripartizione

B. L'eluizione a stadi si utilizza quando si
vogliono separare due sostanze che presentano un
coefficiente di ripartizione molto diverso tra la
fase fissa e la fase mobile utilizzate.
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C. Eluizione a gradiente di potere eluente la
variazione della composizione della fase mobile è
progressiva, anziché brusca come nel metodo a
stadi.
Questo metodo di eluizione viene utilizzato
soprattutto quando le sostanze che costituiscono
la miscela in studio presentano valori molto
diversi di coefficiente di ripartizione tra fase
fissa e fase mobile.
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I componenti che si eluiscono dalla colonna
possono essere misurati da un rivelatore e/o
essere raccolti per ulteriore analisi.
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Cromatogramma e parametri che influenzano la
risoluzione cromatografica
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Wb1ampiezza del picco1 Wb2ampiezza del
picco2 Vr1il volume del picco 1 Vr2il volume
del picco 2
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Risoluzione è la misura della separazione
relativa raggiunta tra due materiali
cromatograficamente distinti
Wb1ampiezza del picco1 Wb2ampiezza del
picco2 Vr1il volume del picco 1 Vr2il volume
del picco 2
La massima risoluzione è lo scopo primario di
ogni purificazione
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Capacità o fattore di risoluzione
k
E la misura della ritenzione di un componente
del campione
da non confondere con la capacità di caricamento
della colonna
Vm volume della fase mobile Vr2 volume di
eluizione del picco 2
k
Vr2-Vm
Vm
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EFFICIENZA (N)
Pick1
E la misura dellampiezza del picco di eluizione
della colonna
Pick2
Vr1
Vr2
Wb1
Wb2