Poluentes Ambientais:

1
Desreguladores endócrinos
UnB

• Poluentes Ambientais
• relações de causa e efeito
• Isabella Gontijo de Sá Leão
• Orientador Francisco de Assis Rocha Neves
• Programa de Pós-Graduação em
• Ciências da Saúde/UnB
• 14 de agosto de 2012

2
Esta apresentação...

• O que são EDCs e como funcionam
• O que são POPs e como atuam
• Mecanismo de ação dos hormônios que agem em
  Receptores Nucleares
• Mecanismos de interferência endócrina e
  metabólica
• Hipótese obesogênicos ambientais?
• Adipogênese mediada pela ativação in vitro do
  receptor Glicocorticóide_Nature Obesity, 2010
• Níveis circulantes de POPs no tecido adiposo
  visceral e subcutâneo_Nature Obesity, 2011
• Considerações finais

3
O que mudou depois da revolução industrial?

• Fatos
• Queda no número de espermatozoides
• Incidência de câncer (12 das mortes no planeta)
  e malformações (maior causa de mortes em crianças
  até 1 ano)
• Depressão e ansiedade
• Arritmia e doenças cardíacas
• Diabetes 2
• Obesidade

• Fatos
• Incremento da CO2
• Crescimento das cidades
• Desenvolvimento da indústria farmacêutica
• Uso de insumos plásticos e metais pesados em
  produtos domésticos
• Industrialização da agricultura
• 400 milhões de toneladas de produtos químicos/ano

4
(No Transcript)
5
Desregulador endócrino ad hoc
6
Desreguladores endócrinos...Afetam
7
O que é um desregulador endócrino?

• Endocrine disruptor chemical
• An endocrine disruptor is an exogenous substance
  or mixture that alters functions of the endocrine
  system and consequently causes adverse health
  effects in an intact organism, its progeny, or
  (sub)populations

• Termo cunhado por
• Ana Soto e
• colaboradores em 1993.

8
Poluentes ambientais conhecidos e seus efeitos
Vida média de 8 anos em humanos
9
Mecanismos de interferência endócrina
Bigsby et al. 1999. Environmental Health
Perspectives Vol 107, Supplement 4.
10
Como avaliar o efeito do interferente endócrino?
11
Modelos em toxicologia para estudar EDCs
Bigsby et al. 1999. Environmental Health
Perspectives Vol 107, Supplement 4.
12

• Poluentes Orgânicos Persistentes POPs ? EDCs
• Resistentes à degradação química, biológica e
  fotolítica

13
Sobre os POPs...

• Silent Spring
• Rachel Carson 1962
• Queda na população de Aves
• DDT (dicloro-difenil-tricloroetano)
• Todos pesticidas organoclorados são
• persistentes

14
Fontes dos POPs
15
(No Transcript)
16
(No Transcript)
17
Interferência hormonal
18
Como os hormônios funcionam?
19
O que é um receptor nuclear?
Janosek et al. Toxicology in Vitro 20 (2006) 1837
20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
(No Transcript)
23
O que são os PPARs?

• - Receptores ativados por proliferadores
  peroxissomais...PPARs
• - Sensor de lipídeos ou sensor metabólico
• Induzem a proliferação de peroxissomos
• ? PPARa ? no fígado ? oxidação
• de ácidos graxos

Xenopus laevis
24
O que é o PPAR??

• Presente principalmente tecido adiposo, fígado,
  pâncreas, monócitos, macrófagos e trato
  digestivo.
• Duas isoformas conhecidas splicing
  alternativo.
• Papel diferenciação e proliferação de
  adipócitos ativa a cascata de reações que
  envolvem a estocagem de ácidos graxos
• ? capacidade de estoque
• ?fluxo de ácidos graxos para o adipócito

25
Quem são os ligantes do PPAR??

• Naturais

• Sintéticos

26
(No Transcript)
27
Múltiplos mecanismos de ação de EDCs
28
Porque armazenar energia?

• Vertebrados e artrópodes
• Sobrevivência
• Processos ecológicos
• Migração
• Sazonalidade de habitats
• Nichos específicos/endêmicos
• Hibernação
• Lactação
• Reserva de emergência
• Termorregulação
• Proteção mecânica
• Territorialidade ? fezes
• Acasalamento
• Cuidado parental (incubação e aquecimento dos
  filhotes)

29
A moeda de energia...

• Tecido especializado
• Armazenamento
• Manejo
• Adipócitos 40 a 85 de triglicerídeos
• Oriundos de quilomícrons e LDL
• Ácidos graxos de longa cadeia ? preservados nas
  teias alimentares
• Guardam mais energia por unidade de massa do que
  os carboidratos
• Insolúveis
• Compactos
• Não-tóxicos para as células mantenedoras

30
Como o adipócito captura a gordura...

• Triglicerídeos
• Hidrolisados pela LPL (lipoproteína LIPASE)
• LPL
• Produzida por Adipócitos e exportada para a
  superfície de células endoteliais
• Ácidos graxos são então liberados ?adipócitos
• Insulina e Cortisol ? ? expressão da LPL
• Inibem a atividade da LPL
• Testosterona
• GH
• Catecolaminas
• TNF

31
(No Transcript)
32
Relação entre massa corpórea e massa adiposa
33
Obesidade animal

• 0.01 nL ? morcego
• 4 nL ? baleia
• (tamanho do adipócito)
• Humanos, ratos e pequenos herbívoros ? 0.1 a 1
  nL
• Domésticos (40 a 85)
• Animais selvagens (máx. 46)
• (composição dos adipócitos)
• 10 vezes mais adipócitos do que
• Animais naturalmente obesos
• - Coelhos, lebres e raposas lt 1

34
Obesidade...fenótipo ou doença?

• Um dos mais graves e crescentes problemas de
  saúde pública do século XXI...

Fig. Proporção de adultos e crianças obesos e com
sobrepeso na Inglaterra. (The Health Survey for
England 2009).
35
Enfrentamos uma epidemia?
Fig. Relação entre a massa corpórea e mortalidade
cardiovascular em homens e mulheres americanos
que nunca fumaram e sem doenças preexistentes.
in Willians Textbook of Endocrinology, 12th
edition, 2011. Melmed et al.
36

• VARIÁVEIS...
• Padrão de distribuição da gordura corporal
• Excesso de gordura abdominal (T.A.visceral)
• Hipertensão
• Dislipidemia
• Doença coronariana isquêmica
• Idade
• Outras doenças preexistentes
• Ganho de peso na idade adulta
• Atividade física e aeróbica
• Etnia (asiáticos são mais propensos)
• ...exposição aos EDCs?

Fig. Relação entre a massa corpórea e o diabetes
tipos dois em mulheres americanas. in Willians
Textbook of Endocrinology, 12th edition, 2011.
Melmed et al.
37
Obesidade...
Herança genética X Fatores Ambientais
Comportamento, sono, disponibilidade de
alimento, escolaridade, dieta ocidental...
38
Sobre EDCs e adipogênese via RNs
Obesity, 2010 F.I. 4.284
39
Hipótese inicial...

• Ativação do GR? indução da adipogênese in vitro
• EDCs poderiam
• competir com o cortisol
• Alterar atividade da 11-ß- hidroxiesteróide
  desidrogenase 1 e 2 ? cortisona ? cortisol
  ?cortisona (no TA)
• Objetivo
• Avaliar ação de EDCs sobre o GR... (inédito em
  pré-adipócitos)
• Screening de EDCs para atividade do GR
• Ensaio de gene repórter
• Ensaio de diferenciação de adipócitos
• Coquetel fraco de DHC (dehidrocorticoesterona)
• Coloração com óleo vermelho
• Western blot de marcadores do TA

40
Superfamília de receptores nucleares

• Estruturalmente relacionados ? homodímeros
• recrutam a maquinaria de transcrição ?
  remodelagem da cromatina
• Conferem plasticidade fenotípica ? adaptação e
  homeostase

Múltiplas Versões de um mesmo receptor splicing
alternativo
41
Estrutura dos receptores nucleares
- 50.000 a 100.00 daltons
Estrutura resolvida para vários receptores
Escala de atuação do DBD -Cromatina
42
Como agem os ligantes de RNs?

• Núcleo da célula-alvo ? regulam a expressão
  gênica
• Universo... ? ENCODE project The eukaryotic
  genome as a RNA machine. Amaral et al. (2008)
  Science
• Lipofílicos
• Derivados da dieta ou de precursores metabólicos
• Massa lt 1000d
• São codificados no genoma? Nem todos...
• Descoberta ? purificação de glândulas
• Entrada na célula difusão ou transporte mediado
  por proteínas de membrana
• LIPOFILICIDADE ? absorvidos no trato
  gastro-intestinal

• Antagonistas
• Competição com o ligante
• Sítio próprio
• Recrutam co-repressores

Potencial para o uso farmacológico
43
in Willians Textbook of Endocrinology, 12th
edition, 2011. Melmed et al.
Sinalizam pistas intracelulares e ambientais...
Transduzidas pelos receptores nucleares...
44
Como agem os glicocorticóides?

• Hormônios esteroides ? córtex da adrenal
• Resposta ao estresse físico e emocional ?
  homeostase
• Bloqueiam o processo de inflamação
• Suprimem a ativação do sistema imune
• Gliconeogênese
• ? glicemia
• Mobilização da oxidação de ácidos graxos
• Incrível potencial farmacológico
• Imunossupressores
• Inflamação crônica
• Efeitos adversos diabetes, perda muscular e
  retardo de crescimento (inibição do GH) e
  lipodistrofia

Cortisol
45
Receptor Glicocorticóide Ad hoc

• NR3C1 gene ? cromossomo 5 em humanos
• Fator de transcrição que também regula outros
  fatores de transcrição...
• Expresso em quase todas as células
• Regula genes
• Desenvolvimento
• Metabolismo
• Resposta Imune
• Resposta adaptativa ao estresse
• Receptor não ligado reside no citoplasma ? heat
  shock proteins
• Complexo GR ligante ? translocado para o núcleo
• ? Expressão de proteínas anti-inflamatórias
• ? Expressão de proteínas pró-inflamatórias
• Mecanismos de ação
• Transativação ? GRE ? ativação da transcrição
• Transrepressão ? se liga ao NF?B e AP-1 e reprime
  expressão
• Agonistas Dexametasona, Progesterona e DHEA

46
Receptor nuclear, subfamília 3, grupo C, membro 1
47
Vias de sinalização...
http//nrresource.org/Pathways/gr_targets.html
48
O que se sabe sobre a ação de POPs em RNs?
Casal-Casas Desvergne. 2011, Annual Review of
Physiology, 73135-162.
49
Delineamento experimental
50
Ensaio de gene repórter

• Atividade do receptor
• Expressão gênica
• Transdução de sinal
• Interação proteína-proteína

• Transfecção transitória e ensaio de gene repórter

Quantificação no luminômetro
Pré-adipócito
51
Figura 01. Compostos desreguladores endócrinos
induziram a expressão da luciferase.
Tóxico em µmolar
52
Como EDCs ativam a adipogênese?

• A ativação do heterodímero RXR-PPAR? favorece a
  biossíntese de lipídios e seu estoque.

53
Como EDCs promovem a adipogênese?
Adipócito maduro
Pré-adipócito
A expressão simultânea do PPAR? e da C/EPBa
(CAAT/proteína promotora de ligação) é sinérgica
e mantém o estado diferenciado do adipócito
maduro. Coquetel 10 SFB DMEM DHCINSULINA
IMBXEDCs...
54
Figura 02. Compostos desreguladores endócrinos
induziram a adipogênese in vitro.
11.4 nm/l urina e 290 nm/l no sangue
5.94 nm/l plasma
1µmolar ?100 pmolar/l
55
Figura 03. Indução da adipogênese in vitro por
EDCs dependente da dose.
1µmolar ?1 fmolar/l
56
Figura 04. EDCs induzem a acumulação de lipídeos
no ensaio de adipogênese na linhagem de
pré-adipócitos murinos 3T3-L1.
57
EDCs com atividade endócrina relatada...
ENDRIN
58
Em síntese...

• Os quatro principais EDCs testados
• ? a quantidade de lipídeos acumulados
• ? a expressão de proteínas específicas dos
  adipócitos
• Evidências de efeitos pró-adipogênicos ? s
  picomolares
• EDCs outros fatores endógenos efeito
  sinérgico na adipogênese
• Estudos anteriores ? Adipogênse via PPAR?, no
  entanto os agonistas de GR não o estimularam
• EDCs não substituem o efeito da Dexa na
  diferenciação
• Interferência na sinalização do GR ? desregulação
  metabólica? Obesogênico?
• Estudos com hexaclorobenzeno sugerem ? na
  expressão do GR
• Os efeitos observados podem ser mediados através
  de alterações na atividade da 11-ß-
  hidroxiesteróide desidrogenase 1 e 2
• EDCs ? alterações alostéricas na interação com o
  ligante ao LBD do GR
• PPAR? e GR ? diferentes fenótipos Sensibilidade
  X Resistência Insulínica

59
(No Transcript)
60
POPs presentes no tecido adiposo humano
Obesity, 2012 F.I. 4.284
61
Entendendo a hipótese...

• Níveis circulantes de POPs ? plasma X obesidade
• Níveis circulantes de POPs ? distribuição do
  tecido adiposo
• Visceral
• Subcutâneo
• Ressonância magnética abdominal
• Tipos de estudo corte transversal e prospectivo
• Medições feitas num único momento ? prevalência
  (fator causal e efeito de uma patologia
• PIVUS ? Investigação Vascular Prospectiva de
  Idosos de Uppsala
• (estudo de coorte)

in Willians Textbook of Endocrinology, 12th
edition,2011. Melmed et al.
62
Perfil do estudo...

• Análises
• - Níveis de 21 POPs no plasma sanguíneo X
• Áreas de tecido adiposo visceral e subcutâneo
  (MRI)
• ? Subamostra de 287 indivíduos
• Relação VAT/SAT (distribuição da gordura
  abdominal)
• Amostra populacional
• - 1016 indivíduos (homens e mulheres) com 70 anos
  de idade
• Vivem em Uppsala (70 km de Estocolmo)
• Variáveis
• ? Gênero
• Nível educacional
• Nível de atividade física
• Uso de cigarro e medicamentos

63
Análise dos POPs

• Cromatografia de gás de alta
• Resolução e espectrometria de
• Massa de alta resolução
• (conjugados)
• Concentração de POPs no
• Plasma ? lipídeos ng/g de
• Lipídeo
• 10 mm Steady-state free
• Precession slice imaging
• ? MRI técnica
• ANOVA (Análise da variância)
• Análise de relação não-lineares
• (não monotônicas)

64
Influência dos POPs? sobrepeso e obesidade no
plasma
65
Influência dos POPs? sobrepeso e obesidade no VAT
e SAT
66
Em síntese...

• Relações não lineares com dados adicionais
• Consumo calórico
• Percentual de gordura ingerida
• Apenas efeitos marginais, sem alterar a
  significância dos resultados
• OCs lt 5 substituíçoes cloradas ? correlação
  positiva com a presença de gordura abdominal
  (visceral e subcutânea)
• Ocs gt 6 substituições ? correlação negativa
• PCB 189
• Papel na deposição do TA?
• Relação com downregulation de
• Receptores em ? s?
• Novidade metodológica
• Resultados diferentes com populações
• mais jovens

67
Complexidade do estudo de EDCs
68
Pausa para reflexão...
69
O que a indústria farmacêuticaplaneja ganhar
com os obesos?
70
Observações gerais...

• Abuso do termo função

71
Agora é com vocês...
72
Perguntas para os ouvintes...

• Como os EDCs podem ativar a adipogênese?
• Como é o mecanismo de ação dos hormônios que
  atuam em receptores nucleares?
• O que é um obesogênico?

73

Obrigada! isabellagontijo_at_gmail.com
74

Obrigada! isabellagontijo_at_gmail.com
75

Referências...

• 1. Qi L, Cho YA. Gene-environment interaction and
  obesity. Nutr Rev 200866684694.
• 2. Bessesen DH. Update on obesity. J Clin
  Endocrinol Metab 200893
• 20272034.
• 3. Baillie-Hamilton PF. Chemical toxins a
  hypothesis to explain the globalobesity epidemic.
  J Altern Complement Med 20028185192.
• 4. Grün F, Blumberg B. Environmental obesogens
  organotins and endocrinedisruption via nuclear
  receptor signaling. Endocrinology
  2006147S50S55.
• 5. Hatch EE, Nelson JW, Qureshi MM et al.
  Association of urinary phthalatemetabolite
  concentrations with body mass index and waist
  circumferencea cross-sectional study of NHANES
  data, 1999-2002. Environ Health 2008727.
• 6. Lee DH, Lee IK, Jin SH, Steffes M, Jacobs DR
  Jr. Association betweenserum concentrations of
  persistent organic pollutants and insulin
  resistanceamong nondiabetic adults results from
  the National Health and Nutrition Examination
  Survey 1999-2002. Diabetes Care 200730622628.

76

• 7. Lee DH, Lee IK, Song K et al. A strong
  dose-response relation between serum
  concentrations of persistent organic pollutants
  and diabetes results from the National Health
  and Examination Survey 1999-2002. Diabetes Care
• 20062916381644.
• 8. Hodges LC, Bergerson JS, Hunter DS, Walker CL.
  Estrogenic effects oforganochlorine pesticides on
  uterine leiomyoma cells in vitro. Toxicol
  Sci200054355364.
• 9. Hofmann PJ, Schomburg L, Köhrle J.
  Interference of endocrine disrupters with thyroid
  hormone receptor-dependent transactivation.
  Toxicol Sci
• 2009110125137.
• 10. Gregoire FM. Adipocyte differentiation from
  fibroblast to endocrine cell. Exp Biol Med
  (Maywood) 20012269971002.
• 11. Gregoire FM, Smas CM, Sul HS. Understanding
  adipocyte differentiation.Physiol Rev
  199878783809.
• 12. Grün F, Watanabe H, Zamanian Z et al.
  Endocrine-disrupting organotin compounds are
  potent inducers of adipogenesis in vertebrates.
  Mol Endocrinol 20062021412155.
• 13. Kanayama T, Kobayashi N, Mamiya S, Nakanishi
  T, Nishikawa J. Organotin compounds promote
  adipocyte differentiation as agonists of the
  peroxisome proliferator-activated receptor
  gamma/retinoid X receptor pathway. Mol Pharmacol
  200567766774.

77

• 14. Masuno H, Iwanami J, Kidani T, Sakayama K,
  Honda K. Bisphenol a
• accelerates terminal differentiation of 3T3-L1
  cells into adipocytes through the
  phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Toxicol
  Sci 200584319327.
• 15. Masuno H, Kidani T, Sekiya K et al. Bisphenol
  A in combination with insulincan accelerate the
  conversion of 3T3-L1 fibroblasts to adipocytes. J
  Lipid Res 200243676684.
• 16. Feige JN, Gelman L, Rossi D et al. The
  endocrine disruptor monoethylhexyl- phthalate is
  a selective peroxisome proliferator-activated
• receptor gamma modulator that promotes
  adipogenesis. J Biol Chem
• 20072821915219166.
• 17. Hurst CH, Waxman DJ. Activation of PPARalpha
  and PPARgamma by
• environmental phthalate monoesters. Toxicol Sci
  200374297308.
• 18. Venkata NG, Robinson JA, Cabot PJ et al.
  Mono(2-ethylhexyl)
• phthalate and mono-n-butyl phthalate activation
  of peroxisome
• proliferator activated-receptors alpha and gamma
  in breast. Toxicol
• Lett 2006163224234.
• 19. Gumy C, Chandsawangbhuwana C, Dzyakanchuk AA
  et al. Dibutyltin
• disrupts glucocorticoid receptor function and
  impairs glucocorticoid-induced
• suppression of cytokine production. PLoS ONE
  20083e3545.
• 20. Johansson M, Nilsson S, Lund BO. Interactions
  between methylsulfonyl
• PCBs and the glucocorticoid receptor. Environ
  Health Perspect
• 1998106769772.

78

• 21. Johansson M, Johansson N, Lund BO.
  Xenobiotics and the glucocorticoid
• receptor additive antagonistic effects on
  tyrosine aminotransferase activity in
• rat hepatoma cells. Basic Clin Pharmacol Toxicol
  200596309315.
• 22. Atanasov AG, Nashev LG, Tam S, Baker ME,
  Odermatt A. Organotins
• disrupt the 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase
  type 2-dependent
• local inactivation of glucocorticoids. Environ
  Health Perspect 2005113
• 16001606.
• 23. Atanasov AG, Tam S, Röcken JM, Baker ME,
  Odermatt A. Inhibition of 11
• beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 by
  dithiocarbamates. Biochem
• Biophys Res Commun 2003308257262.
• 24. Odermatt A, Gumy C, Atanasov AG, Dzyakanchuk
  AA. Disruption of
• glucocorticoid action by environmental chemicals
  potential mechanisms
• and relevance. J Steroid Biochem Mol Biol
  2006102222231.
• 25. Cowherd RM, Lyle RE, McGehee RE Jr. Molecular
  regulation of adipocyte
• differentiation. Semin Cell Dev Biol
  199910310.
• 26. Brady MJ, Kartha PM, Aysola AA, Saltiel AR.
  The role of glucose metabolites
• in the activation and translocation of glycogen
  synthase by insulin in 3T3-L1
• adipocytes. J Biol Chem 19992742749727504.