Presentazione di PowerPoint

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LA RACCOLTA DELLE CELLULE STAMINALI
EMOPOIETICHE
2

Stem cell
Stem cell have received a large amount of
attention recently, both in the scientific and
the lay press.
Ematologia Pesaro
3
Long before the worldwide obsession with all
type of stem cell started, the stem cells was
fully accepted in the field of hematology.
Maximov in a scientific presentation in Berlin
in 1909 ..gemeinsame Stamzellen ..
Ematologia Pesaro
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• La cellula staminale emopoietica
• - capacità di autorinnovamento
• capacità di differenziarsi in progenitori
  commissionati
• 
  
• 
  

Ematologia Pesaro
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(No Transcript)
6
Sorgente di cellule staminali per Trapianto di
Midollo Osseo Allogenico
Ematologia, Pesaro
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(No Transcript)
8
(No Transcript)
9
Da più di 40 anni è noto che i precursori
emopoietici circolano nel sangue periferico e che
possono essere utilizzati a scopo trapiantologico
(Goodman et al, 1962) Allo steady-state le
CD34 rappresentano circa lo 0,1 di tutte le
cellule nucleate nel S.P. La semplice
somministrazione di chemioterapia aumenta di
molte volte la quota di PBSC circolanti e questo
avviene dopo 10-16 giorni dal trattamento
(Tarella et
al, 1991 Richman et al, 1977)
Ematologia Pesaro
10
Nel 1988 Duhrsen et al. osservarono che
il G-CSF era in grado di aumentare
considerevolmente il numero dei progenitori
circolanti.
..e che era possibile raccogliere un
numero sufficiente di queste cellule con
procedure di leucoaferesi La
somministrazione di G-CSF per 3-4 giorni
determina un incremento significativo delle CD34
circolanti da 3,8 x 109/l a 61,9 x 109/l pari ad
un incremento di 16,3 volte del loro basale.


(Korbling et al, 1995)

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Luso combinato di chemioterapia seguita
da G-CSF aumenta ulteriormente la mobilizzazione
ed è divenuto il metodo di più vasto impiego.
(To et al, 1990 Gianni et al,
1989 Brugger et al, 1992) a variety of
chemotherapy drugs have been used for
mobilization



(Gillespie et al, 1996)

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Ematologia Pesaro
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Fattori che influiscono sulla raccolta delle
PBSC 1) Complessità biologica del CFU-GM assay,
dipidendente da variabili Presenti in vivo -
età - tipo di patologia
- interessamento midollo osseo
- precedenti chemioterapia
(fludarabina, melfalan, ecc) Presenti in vitro
- tensione di ossigeno -
fattori di crescita delle colonie
(siero fetale,fitoemoagglutinina)
GM-CSF, G-CSF, IL3, IL6,
stem cell factor e loro associazioni)
- presenza di T linfociti e monociti 2)
Diversità metodi di criopreservazione 3)
Diversità criteri di valutazione 4) Mancanza di
standardizzazione
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Criopreservazione delle cellule staminali
emopoietiche (CSE)

• CSE vitali per 2-3 giorni a temperature gt a t. di
  congelamento
• La criopreservazione mantiene inalterate le
  caratteristiche
• biologiche oltre i limiti di tempo naturali.
• Si esegue con congelatore programmato in azoto
  liquido
• Possibili danni della crioconservazione
• 1. Cristalli di ghiaccio e danno degli organuli
  cellulari
• 2. Cristalli di ghiaccio extracellulari e
  disidratazione delle cellule
• 3. Reidratazione ed espansione delle cellule
  durante
• lo scongelamento
• 4. Funzionamento parziale degli enzimi cellulari
  a basse
• temperature con possibile accumulo di
  metaboliti tossici
• intermedi

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Criopreservazione delle cellule staminali
emopoietiche (CSE)

• Crioconservante
• dimetilsulfossido (DMSO) al 5-10
• (disidratazione parziale intracellulare)
• Principi base
• DMSO aggiunto al plasma pochi ml alla volta
  mentre viene
• raffreddato su ghiaccio (reazione esotermica) ?
  midollo
• Viene mantenuto lo stesso profilo termico delle
  componenti
• della miscela
• Controllo della velocità di raffreddamento

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Crioconservazione e scongelamento

• A lungo termine a -196 C, a -80C per brevi
  periodi
• Tempo 3-5 anni (max 10 anni ma con controllo
  della
• vitalità)
• Scongelamento delle sacche a bagno maria
  (37-38C)
• nel più breve tempo possibile
• Reinfusione subito dopo lo scongelamento
  

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STEM CELL TRANSPLANTATION Which non-malignant
diseases ?
ALLO-SCT
AUTO-SCT
Aplastic Anemia Fanconi Anemia Hemoglobinopathies
PNH SCI Wiskott-Aldrich syndrome Hereditary
storage diseases Congenital leucocyte
disfunctions Glanzmann and thromboastenia

- - - - - - - - -
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STEM CELL TRANSPLANTATION Which malignant
diseases ?
ALLO-SCT
AUTO-SCT
AML CML IMF MDS HD/NHL MM HCL Infant
blastomas Renal carcinoma Breast cancer Other
cancers
/- /- /- /- /-
- /- /- /- /- /-
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(No Transcript)
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LEUCEMIE ACUTE
Ematologia Pesaro
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Use of peripheral blood stem cells for autologous
transplantation in acute myeloid leukemia
patients allows faster engrafment and equivalent
disease-free survival compared with bone marrow
cells. Visani G. et al Bone
Marrow Transplant, 1999 91 AML patients
antracycline-based induction
high-dose cytarabine consolidation

from
Jan 1993 to Jun 1996
23
Use of peripheral blood stem cells for autologous
transplantation in acute myeloid leukemia
patients allows faster engrafment and equivalent
disease-free survival compared with bone marrow
cells. Visani G. et al Bone
Marrow Transplant, 1999
88 AML evaluable patients 73
CR 15
Resistant 16 ALLO BMT 44 AUTO
21 AMBT 23 PBSC
(NOVIAG-CSF) neutrophil and plateled recovery
shorter in PBSC toxicity and relapse was
similar
24
Fludarabine-containing regimens severely impair
peripheral blood stem cells mobilization and
collection in acute myeloid leukemia patients.
Visani G. et al Br J
Haematol, 1999
31 AML pt induction/consolidation treatment
containing fludarabine (ICE-FLAN-FLAN) RC 68
after ICE and 84 after ICE-FLAN

25
Fludarabine-containing regimens severely impair
peripheral blood stem cells mobilization and
collection in acute myeloid leukemia patients.
Visani G. et al Br J
Haematol, 1999 To mobilize PBSC 19 pz FLAN
G-CSF (from day 13 at 10mg/Kg) 13 pt (69)
nonmobilizer Second mobilization with G-CSF
not achieved in 8/10 pt insufficient in 2/10 pt
(lt1x106 CD34/Kg)
26
Fludarabine-containing regimens severely impair
peripheral blood stem cells mobilization and
collection in acute myeloid leukemia patients.
Visani G. et al Br J
Haematol, 1999 harvest adequate in 92 (mean
of 8,8x108/Kg nucleated cells) and ABMT performed
in 10/12 pt
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Esperienza di Pesaro
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Mini-ICE effectively mobilises peripheral blood
stem cells after fludarabine-based regimens in
acute myeloid leukemia Mele A, Leopardi G,
Sparaventi G, Nicolini G, DAdamo F, Guiducci
B, Barulli S, Malerba L, Stramigioli S,
Talevi N, Politi P, Isidori A, Malagola M,
Piccaluga P, Visani G. Department of
Haematology, Hospital San Salvatore Pesaro
Trasfusional Centre-Hospital San
Salvatore-Pesaro, Institute of Haematology and
Medical Oncology, Seragnoli, University of
Bologna
Eur J Haematol, 2005
Ematologia Pesaro
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Mini-ICE effectively mobilises peripheral blood
stem cells after fludarabine-based regimens in
acute myeloid leukemia. mobilization and
collection of PBSC of a low dose regimen
5-days-Mini-ICE administered after fludarabine
based regimens in seven adult AML patients. -
oral idarubicin 20 mg/mq on day 1, 3 and 5 -
etoposide 100 mg/mq twice a day, days 1-3 -
ARA-C 50 mg/mq s.c. twice a day for 5 days)
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Characteristics of patients submitted to Mini-ICE
therapy
Sex
Age (y)
FAB
Karyotype
diagnosis
Case
1 2 3 4 5 6 7
F M F F F F M
M4 M0 M4 M0 M1 M4 M0
de novo de novo de novo post MDS de novo de
novo de novo
29 34 56 63 33 33 40
47XX 22 inv16 4 normal n. v. n. v. Inv.16,
t(1521) 47 XY8
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DCE (7)
PR (1)
NR (6)
FLAG I
DCE II
CR (6)
FLAG II
CR (7)
Mini-ICE G-CSF(7)
Harvest
Abbreviation DCE, daunorubicin, cytarabine,
etoposide PR, partial remission NR, not
responders FLAG, fludarabine, cytarabine CR,
complete remission Mini-ICE, idarubicine,
cytarabine, etoposide G-CSF, granulocyte colony
stimulating factor.
Ematologia Pesaro
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Table I. Characteristics of patients submitted to
Mini-ICE therapy
Sex
Age (y)
FAB
Karyotype
diagnosis
Case
apheresis (n)
CD34 cells (x 106/Kg) collected
1 2 3 4 5 6 7
F M F F F F M
M4 M0 M4 M0 M1 M4 M0
de novo de novo de novo post MDS de novo de
novo de novo
29 34 56 63 33 33 40
1 1 1 2 2 2 2
10.9 10.1 15.2 3.08 3.1 4,49 8,1
47XX 22 inv16 4 normal n. v. n. v. Inv.16,
t(1521) 47 XY8
Ematologia Pesaro
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Median number of harvested CD34 cells was
8.1x106/Kg (range 3.08-15.2). All the
patients were successfully submitted to PBSC
transplantation. We suggest that the Mini-ICE
program is feasible, well tolerated and effective
in terms of PBSC mobilization and collection in
low yield AML patients previously treated with
fludarabine.
Ematologia Pesaro
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Whatever mobilizing and/or releasing regimen is
used, in a small proportion of patients a
sufficient dose of PBSC cannot be collected (poor
mobilizer)
Ematologia Pesaro
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Pegfilgrastim effectively mobilizes PBSC in a
poor mobilizer multiple myeloma patient a case
report Lara Malerba, Anna Mele, Giuliana
Leopardi, Stefania Stramigioli, Patrizia
Politi, Giuseppe Visani Department of
Haematology- Hospital San Salvatore- Pesaro,
Italy, Trasfusional Centre-Hospital San
Salvatore-Pesaro, Italy    
Haematologica, in
press
Ematologia Pesaro
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• December 2003, a 65-year-old man III A IgG/k
  multiple myeloma.
• 3 couses of polichemotherapy (DC-IE)SD.
• - cyclophosphamide (7g/sqm) plus daily 10 ?g/kg
  G-CSF in order to mobilize PBSC, without
  success.
• After two months off therapy, the disease
  progressed and the patient received alternate
  cycles VAD/high dose dexamethasone.
• A second attempt to mobilize PBSC, using daily 10
  ?g/kg G-CSF after the second and third VAD
  cycle, failed.
• Single dose of 12 mg pegfilgrastim
• on day 5 after a fourth VAD course.
• On day 10 post chemotherapy the CD34 cell
  count was 24/microlitre and two apheresis were
  performed, harvesting 1,6x106 and 0,89x106 CD34
  cell/kg, respectively(total 2,49x106 cells/kg).
• The only side effect was moderate skeletal pain.
• The patient underwent successful transplantation.
  
•  

Ematologia Pesaro
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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..passaggio dal midollo al sangue periferico
come fonte di cellule staminali
SOURCE OF STEM CELLS
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• A FAVORE PBSC
• precocità e stabilità dellattecchimento
• equivalenza, se non addirittura riduzione, della
  incidenza e della gravità della GVHD acuta
  (Korbling et al, 2001
• 
  Besinger et al, 2001)
• recupero immunologico più veloce
• riduzione dei tempi di ospedalizzazione
• - ..no anestesia generale e/o spinale

Ematologia Pesaro
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• CONTRO
• incremento GVHD cronica (Brown et al, 1999)
• impegno prolungato 5-7 giorni stimolazione,
  2-3 leucaferesi, effetti collaterali, accesso
  venoso etc..

Ematologia Pesaro
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PROTOCOLLO PILOTA ESPLORATIVO DI APPLICAZIONE E
DI STUDIO DEL TRAPIANTO APLO-IDENTICO DI CELLULE
STAMINALI IN PAZIENTI AFFETTI DA EMOPATIE MALIGNE
AD ALTO RISCHIO E/O RESISTENTI CHE NON DISPONGONO
DI DONATORE FAMILIARE HLA IDENTICO O MISS-MATCH
UNRELATED (MUD).  
Ematologia Pesaro
Ematologia Pesaro
43
Lesperienza di Pesaro Solo in casi selezionati
vengono utilizzate PBSC (TMO aplo-identico TMO
con malattia in almeno II RC) Preferenza delle
cellule staminali da Midollo Osseo!!
Ematologia, Pesaro
44

Probabilità di avere un donatore HLA
identico 25 familiare HLA identico 50-60
matched unrelated donor (MUD)

spesso però il tempo della ricerca è
inconciliabile con lurgenza clinica delle
emopatie acute.
Ematologia Pesaro
45
Per contro sono quasi sempre disponibili
familiari (genitori, figli, fratelli)
incompatibili per due-tre loci che possono
essere immediatamente disponibili come
donatori !!
Ematologia Pesaro
46
Concetto della Megadose MEGADOSE CD34 (CD34 gt
106 cellule/Kg) in grado di consentire
lattecchimento con ricostituzione ematopoietica
full-donor
rigetto mediato dai precursori dei linfociti T
Citotossici del ricevente (CTL-P)
Ematologia Pesaro
47

• TRAPIANTO APLO-IDENTICO
• 2005Pesaro
• Concetto della Megadose (ab)
• a) PBSC con selezione in positivo
• CD34 mediante CliniMACS
• b) midollo con selezione in negativo
• (T deplezione) mantenendo quota
  linfociti T
• CD3 nellinoculo (1,8x105/Kg)
• 
  effetto GVL

Ematologia Pesaro
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Ragazza di 12 anni LAM M1 (trisomia del 4)
diagnosticata nel giugno 2002 in seguito ad esami
ematochimici eseguiti per pallore ed astenia
Hb4,2 gr/dl Bl20 nel SP e 80 nel MO TERAPIE
ESEGUITE c/o altro Centro 21-27/6/2002 ICE
secondo AIEOP LAM 2002 NR 8/2002
FLANGDaunoxome NR 9/2002 MEC Persistenza
di malattia
Ematologia Pesaro
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Giunge alla nostra attenzione nel ott. 2002
con GB400 Hb8,2 PLT29000 Figlia
unica, no donatori da banca
HLA-A HLA-B HLA-C Madre 01,
68 44, 53 04, 16 Figlia 01,
68 53, 57 04, 16
Ematologia Pesaro
Ematologia Pesaro
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TRAPIANTO Condizionamento BU 16, Thiotepa 10,
Endoxan 160, ATG 15mg/Kg. Profilassi
GVHD CSA, sMTX DON/RIC 0 NEG/B
NEG REINFUSIONE CELLULE STAMINALI il
28-11-2002 con selezione in positivo
CD34 GVHD acuta 13 (metilprednisolone 2
mg/Kg) Mucosite grado II
Ematologia Pesaro
Ematologia Pesaro
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Il g21 DNA 100 Donor, RC ematologica,
assenza trisomia 4 Ha sospeso
la terapia immunosoppressiva il 27-9-03
Ultima valutazione ( 6 anni) nel 11-2008 R.C.,
stabile attecchimento allogenico (100 donor),
assenza trisomia del 4.

nessuna terapia
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