Espectrometria de Massa: Fundamentos e aplica

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Espectrometria de Massa Fundamentos e aplicações
em proteômica
Dr. Luciano da Silva Pinto
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Introdução

• O que é Espectrometria de massa?
• É o estudo de sistemas que causam a formação de
  íons gasosos com ou sem fragmentação que é
  caracterizada então pela relação massa/carga e
  abundância relativa (Mede a massa de moléculas
  individuais que tenham sido convertidas em íons).
• Relação m/z unidade de massa atômica por
  unidade fundamental de carga
• Em muitos casos, os íons encontrados no
  espectrômetro de massa possuem uma carga (z 1)
  e, então o valor m/z é numericamente igual à
  massa molecular iônica em unidades de massa
  atômica.

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Espectrometria de Massa é usada para....

• Biotecnologia na análise de proteínas, peptídeos
  e oligonucleotídeos, monitoramento de
  fermentação
• Agropecuária Análise e controle de qualidade de
  rações
• Farmacêutica Descobertas de novas drogas,
  farmaco-cinética
• Clínica Análise da hemoglobina, teste de drogas
• Ambiental Qualidade de água, contaminação em
  alimentos
• Geologia Composição do petróleo, análise de
  solos
• Esportes Identificação de esteróides
• Medicina Forense Investigação de crimes

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Aplicação da Espectrometria de Massa em
proteômica

• Informação de massa molecular Com precisão
• Identificação de proteínas usando massa molecular
  de peptídeos trípticos
• Informação Estrutural
• Sequenciamento de peptídeos
• Identificar modificações pós-traducionais
  (fosforilação, glicosilação e pontes de sulfeto).

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História da espectrometria de massa

• J.J. Thomson (University of Cambridge)
• 1897 estudos da descarga elétrica de
  gases (descobrimento do elétron).
• 1906 Prêmio Nobel (construção do primeiro
  espectrômetro- espectrógrafo de parábola) para
  a determinação das razões massa-carga dos
  íons.
• Francis W. Aston (University of Cambridge) 1922
  Prêmio Nobel (estudos isotópicos com um novo
  espectrômetro de massa de maior resolução-
  íons dispersos pela massa e focalizados pela
  velocidade).

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História da espectrometria de massa

• 1960- MALDI e ESI- Hillenkamp e Fenn (Prêmio
  Nobel)

Evolução
Prêmio Nobel de Química, 2002 foi para os
inventores de métodos de ionização branda em
espectrometria de massa - permitiu análise de
macromoléculas
Koichi Tanaka (Japão) - Soft Laser Desorption
(SLD).
John B. Fenn (E.U.A.) - Electrospray (ESI)
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Como um espectrômetro de massa trabalha?
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Espectrometria de massa
MODOS DE IONIZAÇÃO PARA BIOMOLÉCULAS
ANALISADORES DE MASSA
FTICR (Fourier Transform cyclotron
resonance) ION TRAP TRIPLE QUADRUPOLE TIME OF
FLIGHT (TOF) Orbitrap
Setor magnético
ELECTROSPRAY
MALDI (matrix assisted laser desorption
ionization)
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Métodos de Ionização
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Fonte de íons
Métodos agressivos de ionização (fragmentos podem
não ser detectados)
Métodos suaves de ionização
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Ionização por electronspray (ESI)

• Adequado para análise de moléculas termolábeis,
  como proteínas.
• Ionização ocorre pela nebulização de gotículas
  (nanolitros) de uma solução em um campo elétrico
  intenso, formando gotículas altamente carregadas.
  

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Ionização por electrospray
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Equilíbrio de estados múltiplos da carga
Ionização por eletrospray
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Origem do Espectro de Massa dos Peptídeos por ESI
m/z (Mr3H)/3
m/z (MrH)
4
3
2
1
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
m/z (Mr4H)/4
m/z (Mr2H)/2
ES-MS
2
3
Rel. Inten.
1
4
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Vantagens do electrospray

• 1) Apropriado para compostos carregados, polares
  e básicos
• 2) Permite a detecção de compostos de alta massa
• molecular - maioria dos espectrômetros de massas
• 3) Melhor métodos para análises de compostos
• multicarregados
• 4) Baixo ruído químico permite ótimos limites de
  detecção
• 5) Permite o controle de fragmentações
• 6) Compatível com métodos de MS/MS

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Ionização por MALDI (Matrix Assisted Laser
Desorption Ionization)
A amostra é misturada com uma matriz que absorva
UV.

• A matriz absorve energia do laser o que causa sua
  volatilização junto com a volatilização da amostra

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Matrizes
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Preparo das amostras
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Vantagens do MALDI

1. Ionização suave análise de biomoléculas
   intactas,
2. Extensa faixa de massa (gt 400 kDa)
3. Análise de misturas - sem purificação
4. Alta sensibilidade
5. Fácil interpretação dos dados
6. Tampões e sais tem pouco efeito
7. Rápida
8. Fácil uso e manutenção

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Analisadores de Massa
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Analisadores de Massa

• Após sua formação, os íons são acelerados
  para o analisador de massa através de um campo
  elétrico.
• O analisador de massa separa os íons de
  acordo com suas razões m/z.
• Os analisadores de massa podem ser
  contínuos ou pulsados
• Contínuos transmitem um simples íon de razão
  m/z ao detector (quadrupolos e campo magnético).
• Pulsados coletam um espectro de massa inteiro a
  partir de um pulso simples de íons (TOF).

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Analisador Tempo de Vôo (TOF)
Mede o tempo que íons de diferentes massas levam
para mover-se da fonte de íons até o detector
Íons menores chegarão primeiro ao detector.
Existem dois tipos de analisadores TOF
linear e refletor.
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MS-TOF

• MS tempo de vôo
• Sem campo elétrico ou magnético,
• Ao contrário de outros MS, não há limite
  superior de detecção de m/z.
• É o mais preciso de todos os MS, permitindo
  análise elementar. Podem fazer até 100 espectros
  por segundo.

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MS de setor magnético
Ionização um feixe de elétrons de alta energia
é utilizado para ejetar um elétron de uma
molécula, formando um radical catiônico designado
como íon molecular. Se o íon molecular for muito
instável ele poderá se fragmentar em íons
menores. Analisador de massa os íons
moleculares são focalizados, formando um feixe,
são acelerados através de um campo magnético,
sendo defletidos (desviados) de acordo com as
massas dos íons.
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Analisadores de massa Quadrupolo

• Quatro eletrodos, dois positivos e dois
  negativos.
• A voltagem aplicada afeta a trajetória de íons
  passando através dos eletrodos. Para uma dada
  condição de corrente e voltagem, somente íons com
  uma determinada razão massa/carga seguem o
  trajeto entre os tubos, e todos os outros são
  desviados para fora.
• Obtém-se um espectro de massas variando-se
  gradualmente a corrente e voltagem para
  detectar-se todos os íons presentes.

MS quadrupolo de transmissão consiste de um
ionizador, lentes para acelerar e focalizar os
íons para a entrada no quadrupolo, o quadrupolo
com controles de V e A, um detector de íons. Todo
o sistema necessita de alto vácuo. Resolução
separa íons com diferenças de 0.3 m/z
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ESQUEMA DE UM ESPECTROMETRO DE MASSA
TRIPLO-QUADRUPOLO
IONIZAÇÃO ELETROSPRAY - analíto e solvente são
submetido a alta voltagem (3-4 kVolts) Q1 1º
QUADRUPOLO (DC/Rf) - modo MS (Q1) determina
massa/carga (m/z) - molécula intacta Q3 2º
QUADRUPLO (DC/Rf) - modo MS/MS (Q3) detecta
fragmentação dos ions - estrutura CÉLULA DE
COLISÃO HEXAPOLO (somente Rf) Dissociação por
colisão induzida - fragmetação
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Analisadores de massa Íon-trap
MS Íon-trap formado por um quadrupolo
tridimensional

• Consiste de eletrodos cilíndricos simétricos,
  que formam dois end caps e um anel. Pode ser
  bastante pequeno, com somente 1-2 cm separando os
  eletrodos.
• Face interna de cada eletrodo tem uma superfície
  hiperbólica.
•  
• Ainda que a resolução do MS ion trap seja mais
  baixa, apresenta como vantagem a pré-concentração
  do íon de interesse antes da análise.

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Analisador por ressonância ciclotrônica de íons e
transformada de Fourrier - FTICR

• Consiste de três pratos paralelos dispostos na
  forma de um cubo, usados para capturar, excitar e
  detectar íons em uma célula pequena.
• Os íons capturados, sob a influência de
  um campo magnético movem-se em uma
  trajetória circular de raio r e freqüência w

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Analisador por FTICR
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Orbitrap
LTQ-Orbitrap
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Detectores
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Multiplicador de elétrons

• Multiplica uma corrente eletrônica, por
  aceleração de elétrons na superfície de um
  eletrodo.
• A colisão libera um número de elétrons
  secundários maior que o número de elétrons
  incidentes. Os elétrons secundários são
  acelerados também por um outro eletrodo que por
  sua vez libera outros elétrons secundários e
  assim por diante, resultando em uma amplificação
  do sinal.

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Placa de Micros Canais (MCP)

• Um arranjo de capilares de vidro
• paredes internas
• material condutor de energia elétrica
• alta voltagem
• íon que colidir na parede interna dos capilares
  criará uma avalanche de elétrons secundários

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Placa de Micros Canais (MCP)
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Resolução dos espectrômetros de massa
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(No Transcript)
37
(No Transcript)
38
(No Transcript)
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Aminoacidos são as subunidades das proteínas
Cadeia lateral
ALANINA
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Aminoacidos são ligados por ligações peptídicas
para formar a cadeia polipeptídica
Uma cadeia de polipeptídeos tem duas regiões
terminais (amino- ou N-terminal e carbox- ou
C-terminal) e possui uma espinha dorçal
regularmente repetida mas com diferentes resíduos
(R1, R2, R3, R4, R5)
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Massa Molecular de um Peptídeo/Proteina
Mr Soma de todas as massas dos resídos 18
(H2O)
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O espectro de massas de uma molécula
consiste de uma família de picos, correspondendo
a espécies carregadas que diferem de 1 unidade de
massa e carga. A deconvolução
desses picos, gerando o gráfico acima, dá a massa
de uma molécula com precisão de 0,01
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Sequenciamento de novo de proteínas por
espectrometria de massas
Para sequenciar proteínas é preciso obter o
espectro MS/MS de seus peptídeos. 2 etapas de MS
acopladas. Depois de fazer o MS da molécula
inteira, esta é fragmentada dentro do aparelho
por colisão com gases. Os fragmentos são então
separados e analisados por MS.
hélio ou argônio
A ligação peptídica se quebra formando fragmentos
típicos, como os íons b e y mostrados na figura
acima, que terão massas diferentes de acordo com
o radical R de cada aminoácido.
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Sequenciamento de novo de proteínas
Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a
fragmentação gera uma família de fragmentos
peptídicos com massas que vão diferir uma da
outra em valores que correspondem a um íon b,
permitindo a identificação de cada aminoácido.
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Sequenciamento de novo de proteínas
A sequência obtida pela análise dos íons de uma
série pode ser confirmada pela determinação da
sequência feita a partir da série complementar de
íons, no caso do exemplo, os íons y.
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Código AA Código AA Mono. Código AA  Código AA  Mono.
Gly G 57.021464 Asp D 115.02694
Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858
Ser S 87.032029 Lys K 128.09496
Pro P 97.052764 Glu E 129.04259
Val V 99.068414 Met M 131.04048
Thr T 101.04768 His H 137.05891
Cys C 103.00919 Phe F 147.06841
Leu L 113.08406 Arg R 156.10111
Ile I 113.08406 CMC 161.01467
Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333
- - - Trp W 186.07931
Espectro MS/MS do peptídeo tríptico
GLSDGEWQQVLNVWGK.
Analisa-se o espectro buscando diferenças de m/z
equivalentes a um resíduo de aminoácido, que
permitem conhecer a seqüência do peptídeos


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Pesquisa em bancos de dados
A pesquisa em banco de dados foi realizada com
submissão de massa/carga de 7 mais intensos
peptídeos demonstrados no espectro de massa da
figura e o programa ProteinProspector foi
acertado para a menor especificidade possível,
sem nenhuma restrição ao peso molecular, ponto
isoelétrico e cadeia taxonômica. A pesquisa
envolveu 983900 entradas, sendo que BSA foi
prontamente identificada.
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• Proteínas são identificadas inserindo-se a
  massa dos peptídeos em um banco de dados de
  peptídeos como o ProFound.
• Parâmetros de busca são refinados incluindo
  massa e ponto isoelétrico determinados por 2D
  PAGE.
• http//www.unb.br/cbsp/paginiciais/profound.htm

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Busca em bancos de dados
50
(No Transcript)
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Nanoeletrospry
52
Nanoeletrospray
53
Nanoelectrospray
54
(No Transcript)
55
http//prospector.ucsf.edu/
http//db.systemsbiology.net8080/proteomicsToolki
t/index.html 
http//www.ionsource.com/