Proteomas e Espectrometria de Massa

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Proteomas e Espectrometria de Massa
BIO10-329 Biofísica de Proteínas Regente Célia
R. Carlini
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Principais componentes moleculares da bactéria
E. coli
A tabela mostra a percentagem em peso dos
principais tipos de moléculas presentes em um
célula simples, a bactéria Escherichia coli.
Observe que as proteínas compõem o grupo mais
diverso de moléculas. Antes das
técnicas de proteômica, para se obter informações
sobre uma proteína em particular, era necessário
separá-la de todas as outras que estão presentes
na mesma fonte biológica. Atualmente, é
possível analisar-se um grande conjunto de
proteínas ao mesmo tempo, e obter informações de
uma proteína em particular sem separá-la das
demais, graças às técnicas de espectrometria de
massa acoplada com eletroforese 2D e/ou
cromatografia líquida.
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Atualmente, a capacidade de processamento de
grandes volumes de informações e técnicas
analíticas de alta resolução, entre as quais se
destaca a espectometria de massas, permitem o
estudo de células e organismos inteiros são os
OMAS.
Homo sapiens

• GENOMA DNA 3,4 bilhões de nt

• TRANSCRIPTOMA mRNA 30 mil genes

• PROTEOMA Proteínas 0,3-1,2 milhão proteínas

• INTERACTOMA interações entre proteínas

• SIGNALOSOMA interações entre proteínas
  de uma via de sinalização

• METABOLOMA - metabólitos

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Estratégias experimentais

• Do geral para o particular
• Analisar diversos proteomas em condições
  diferentes e identificar as diferenças

• Do particular para o geral
• Analisar uma única proteína e inferir suas
  funções no contexto do todo

Separação de proteínas nas amostras
Eletroforese bidimensional
Cromatografia líquida (LC)
fragmentação
Determinação de massas para identificação
Peptide mass fingerprint
Sequenciamento de novo
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

• análise simultânea de até 5.000 proteínas

• permite comparação de todas as proteínas
  expressas por uma célula em dois momentos
  diferentes
• análise do efeito de hormônios,
• análise do efeito de drogas
• estados fisiológicos (desenvolvimento)
• condições patológicas diversas (vírus,
• bactérias,etc.)

Eletroforese 2D de proteínas totais (proteoma) de
células de Escherichia coli
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Proteoma Comparativo ou Diferencial
condição
condição
Sobreposição permite identificar diferenças nos
padrões de bandas
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(No Transcript)
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Sobreposição para análise das proteínas
diferentemente expressas
Proteínas de cada condição são marcadas com tags
fluorescentes diferentes para facilitar a
visualização das diferenças
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Interatoma de C. elegans - proteínas
individuais, representadas por círculos,
agrupam-se (indicado por linhas) conforme suas
interações, formando uma rede que permite
entender detalhes do controle das funções vitais
do organismo.
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Identificação de Proteínas por MS 10 passos
(1)
(2)
(3)
Obter espectro de massas dos fragmentos
(4)
(9)
comparação
(8)
Banco de espectros
Identificação
Espectro de massas
(10)
Banco de seqüências (i.e. SwissProt)
(5)
(6)
(7)
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Peptide fingerprint ou impressão digital de
peptídeos proteínas são identificadas com base
no tamanho dos peptídeos resultantes da hidrólise
com tripsina, comparando-se o espectro de massa
real com o teórico, obtido a partir dos bancos de
dados de proteínas.
Massa/carga Mass Tolerance (Da)
Hits in Database
1529 1 478
1529.7 0.1 164
1529.73 0.01 25
1529.734 0.001 4
1529.7348 0.0001 2
Quanto maior a exatidão da medida de massas,
maior a segurança na identificação da proteína
(hits) que originou os peptídeos trípticos.
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Impressão digital de peptídeos efeito de
peptídeos múltiplos
Massa/carga m/z Mass Tolerance Hits
Database
1529.73 0.1 204
1529.73 1252.70 0.1 7
1529.73 1252.70 1833.88 0.1 1
2 peptídeos
3 peptídeos
A identificação de mais de um peptídeo triptíco
de uma mesma proteína aumenta a confiabilidade da
identificação dessa proteína por espectrometria
de massa.
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Espectrometria de Massas
Thomson, 1897 fez descoberta do elétron e
inventou a espectrometria de massa, com a
primeira medida da razão massa/carga de uma
partícula.
Prêmio Nobel de Química, 2002 foi para os
inventores de métodos de ionização branda em
espectrometria de massa, que permitiu análise de
macromoléculas como proteínas John B. Fenn
(E.U.A.) - Electrospray (ESI) Koichi Tanaka
(Japão) - Soft Laser Desorption (SLD).
Espectrômetros de massas usam diferenças na razão
massa-carga (m/z) de átomos ou moléculas
ionizadas para separá-los, e/ou para determinar a
composição e a estrutura química. Moléculas
fragmentam-se de maneiras diferentes, sendo que a
análise MS dos fragmentos permite sua
caracterização estrutural. O poder de separação
de íons de um MS é descrito por sua resolução,
que é definida como R m /D m
sendo m, a massa do íon Dm, a
diferença de massa entre dois picos no

espectro de massa Ex um MS com
resolução de 1000 consegue separar íons com m/z
de 100.0 e 100.1
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O espectro de massas de uma molécula
consiste de uma família de picos, correspondendo
a espécies carregadas que diferem de 1 unidade de
massa e carga. A deconvolução
desses picos, gerando o gráfico acima, dá a massa
de uma molécula com precisão de 0,01
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Analisadores de massa
MS de setor magnético Ionização um feixe de
elétrons de alta energia é utilizado para ejetar
um elétron de uma molécula, formando um radical
catiônico designado como íon molecular. Se o íon
molecular for muito instável ele poderá se
fragmentar em íons menores. Analisador de
massa os íons moleculares são focalizados,
formando um feixe, são acelerados através de um
campo magnético, sendo defletidos (desviados) de
acordo com as massas dos íons.
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Analisadores de massa
Quadrupolo - consiste de quatro eletrodos
(tubos metálicos), dois positivos e dois
negtivos. A voltagem aplicada afeta a trajetória
de íons passando através aos eletrodos. Para uma
dada condição de corrente e voltagem, somente
íons com uma dada razão massa/carga seguem o
trajeto entre os tubos, e todos os outros são
desviados para fora do quadrupolo. Obtem-se um
espectro de massas variando-se gradualmente a
corrente e voltagem para detectar-se todos os
íons presentes.
MS quadrupolo de transmissão consiste de um
ionizador, lentes para acelerar e focalizar os
íons para a entrada no quadrupolo, o quadrupolo
com controles de V e A, um detector de íons. Todo
o sistema necesssita de alto vácuo. Resolução
separa íons com diferenças de 0.3 m/z
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Analisadores de massa
A energia cinética de um íon é 0.5mv2, assim ions
mais leves têm velocidade maior que os pesados e
atingem o detector em menos tempo.
MS-TOF
MS tempo de vôo íons são acelerados a partir do
ionizador até um tubo de vôo, sem campo elétrico
ou magnético, onde se movem na direção do
detector com uma velocidade proporcional a m/z.
Ao contrário de outros MS, não há limite superior
de detecção de m/z. O TOF-MS é afetado pela
energia inicial dos íons antes de serem
acelerados. Para corrigir, utiliza-se um conjunto
de campos elétricos, o reflectron, que
refocalizam os íons de mesma m/z com velocidades
diferentes. É o mais preciso de todos os MS,
permitindo análise elementar. Podem fazer até 100
espectros por segundo. Originalmente desenvolvido
na década 1950, foi obscurecido pelos MS
quadrupolos até o desenvolvimento do MALDI nos
anos 1980.
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Espectrômetro de massa por tempo de vôo
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Analisadores de massa
MS Íon-trap formado por um quadrupolo
tridimensional
Consiste de eletrodos cilíndricos simétricos,
que formam dois end caps e um anel. Pode ser
bastante pequeno, com somente 1-2 cm separando os
eletrodos. A face interna de cada eletrodo tem
uma superfície hiperbólica. Uma corrente e
voltagem são aplicadas ao eletrodo em forma de
anel, enquanto os end caps ficam aterrados.
  De maneira análogo ao MS quadrupolo linear,
variando-se a voltagem ocorrem rápidas inversões
na direção do campo, com os íons sendo
alternadamente acelerados e desacelerados na
direção axial e vice versa na direção radial,
aprisionando-os. Aumentando-se a voltage, os íons
assumem trajetórias instáveis e saem do trap,
numa ordem de m/z crescente. Ainda que a
resolução do MS ion trap seja mais baixa,
apresenta como vantagem a pré-concentração do íon
de interesse antes da análise.
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Técnicas de Ionização
Ionização por impacto de eléctrons (EI)
As moléculas são vaporizadas e bombardeadas com
elétrons de alta energia (70 eV), formando de
íons moleculares () quando esses elétrons
colidem com a molecula e deslocam eléctrons mais
externas. Alguns desses íons são instáveis e de
fragmentam em íons menores. Adequada para
compostos não termolábeis.
Dessorpção por Laser assistida por matriz (Matrix
Assisted Laser Desorption) (MALDI)       Técnica
desenvolvida por Karas e Hillkamp em 1988, para
ionização de peptídeos e proteínas,
oligossacarídeos, glicolipídeos, nucleotídeos,
etc. As amostras são co-cristalizadas
com uma matriz (substância que absorve luz
ultravioleta). Para proteínas, utiliza-se o
ácido sinapínico, que absorve a radiação de 337
nm do laser de nitrogênio. A energia absorvida
pela matriz é transferida para as moléculas,
evitando sua decomposição por calor. Após a
incidência do pulso de laser, uma grande
quantidade de energia é absorvida pela matriz e
há uma "explosão" com emissão de um gás com íons
moleculares com uma carga.
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Mass Spectrometry
Técnicas de Ionização
Matrix-assisted laser desorption ionizaton time
of flight Maldi-Tof
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Técnicas de Ionização
Ionização por electronspray (ESI) Método
adequado para análise de moléculas termolábeis,
como proteínas. O processo de ionização das
moléculas ocorre pela nebulização de gotículas
(nanolitros) de uma solução em um campo elétrico
intenso, formando gotículas altamente carregadas.
Quando o solvente evapora, formam-se íons
moleculares de simples ou múltiplas cargas. Podem
ser formados íons (-) ou (), de acordo com o
campo eléctrico aplicado. No modo positivo,
observam-se adutos alcalinos (protonados) dos
analitos e no modo negativo, os íons são
desprotonados.
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Sequenciamento de novo de proteínas por
espectrometria de massas
Para sequenciar proteínas é preciso obter o
espectro MS/MS de seus peptídeos. Isso significa
2 etapas de MS acopladas. Depois de fazer o MS
da molécula inteira, esta é fragmentada dentro do
aparelho por colisão com gases. Os fragmentos são
então separados e analisados por MS.
hélio ou argônio
A ligação peptídica se quebra formando fragmentos
típicos, como os íons b e y mostrados na figura
acima, que terão massas diferentes de acordo com
o radical R de cada aminoácido.
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Sequenciamento de novo de proteínas
Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a
fragmentação gera uma família de fragmentos
peptídicos com massas que vão diferir uma da
outra em valores que correspondem a um íon b,
permitindo a identificação de cada aminoácido.
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Sequenciamento de novo de proteínas
A sequência obtida pela análise dos íons de uma
série pode ser confirmada pela determinação da
sequência feita a partir da série complementar de
íons, no caso do exemplo, os íons y.
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AA Codes AA Codes Mono. AA Codes  AA Codes  Mono.
Gly G 57.021464 Asp D 115.02694
Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858
Ser S 87.032029 Lys K 128.09496
Pro P 97.052764 Glu E 129.04259
Val V 99.068414 Met M 131.04048
Thr T 101.04768 His H 137.05891
Cys C 103.00919 Phe F 147.06841
Leu L 113.08406 Arg R 156.10111
Ile I 113.08406 CMC 161.01467
Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333
- - - Trp W 186.07931
Espectro MS/MS do peptídeo tríptico
GLSDGEWQQVLNVWGK.
Analiza-se o espectro buscando diferenças de m/z
equivalentes a um resíduo de aminoácido, que
permitem conhecer a seqüência do peptídeos


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perda de H2O 18 u.m. perda de CO2 28 u.m.
Sequenciamento de novo
Íons y
perda de amônia 17 u.m.
Íons b e a
Espectro MS/MS do peptídeo GLSDGEWQQVLNVWGK.
28
http//prospector.ucsf.edu/
http//db.systemsbiology.net8080/proteomicsToolki
t/index.html 
http//www.ionsource.com/