Variazioni epigenetiche

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Variazioni epigenetiche
Modifiche ereditabili, che può riguardare un
cromosoma o lattività di un gene, che non varia
la sequenza nucleotidica.

• Imprinting

• Inattivazione cromosoma X (lyonizzazione)

• Inattivazione centromerica (eterocromatina)

• Effetto posizione.

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• Limprinting genomico consiste nella espressione
  allelica differenziale e parentale-specifica.

Cromosoma materno gene X trascrizionalmente
attivo
Cromosoma paterno geneX trascrizionalmente
inattivo
3
(No Transcript)
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Caratteristiche principali della seq. di DNA dei
geni imprinted

• elevata di CpG islands (bersaglio della
  metilazione)

• Sequenze ripetute vicino alle CpG islands

• Legame parentale-specifico di particolari
  complessi proteici responsabili delle modifiche
  epigenetiche
• ImprintingControlRegions in alcuni clusters di
  geni imprinted.

5
(No Transcript)
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Altre caratteristiche epigenetiche delle regioni
imprinted

• Asincronia nella fase S del ciclo cellulare

• Differenze nella frequenza della ricombinazione
  meiotica vicino o internamente ai clusters
  imprinted

Non si conosce ancora la relazione tra queste
caratteristiche ed il grado di metilazione o la
struttura della cromatina.
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Metilazione differenziale degli alleli parentali
(DMRs)

• La metilazione influisce sul grado di espressione
  genica in modo variabile la metilazione può
  riguardare la copia inattiva o attiva del gene
  (es. gene Igf2).

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Allele 1 (espresso)
CpG
Allele 2
MDBs?
CpG
Metilazione
(a) Promoter methylation
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CpG Igf2r
CpG Air
Allele materno (espresso)
CpG Igf2r
CpG Air
Allele paterno
(b) Antisense transcripts
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CpG of Igf2
Allele materno
CpG of Igf2
Allele paterno (espresso)
Repressore
Metilazione
(c) Silencing factors
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Fattori coinvolti

• DNA cytosine methyltransferases (Dnmt1, Dnmt3a,
  Dnmt3b)

• Methyl-CpG-binding proteins (MECP2)

• Histone acetyltransferase enzymes (GCN5/PCAF)

• ATP-dependent remodelling complexes (ISWI)

• Histone-modification enzymes (H3-K4
  methyltransferases, H3-K9 methyltransferases),

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Alcuni geni sottoposti ad imprinting

• Chr1 (p73)
• Chr5 (U2AFBPL)
• Chr6 (MAS1 M6P/IGF2R..)
• Chr7 (GAMMA2-COP..)
• Chr11 (H19IGF2INS..)
• Chr13 (HTR2A)
• Chr14 (MEG3/GTL2)
• Chr15 (GABRA5GABRB3NDNPAR1PAR5SNRPNUBE3A)
• Chr18 (IMPACT)
• Chr19 (PEG3)
• Chr20 (GNAS1NEURONATIN)
• ChrX (XIST).

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• Imprinting genomico
• Cosè limprinting?
• Meccanismi molecolari responsabili
  dellimprinting
• Regione 15q11-13 e sindromi di PraderWilli-Angelma
  n
• Modifiche epigenetiche nella regione critica
  15q11-q13.

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Imprinting nella regione 15q11-q13

• Geni espressi paternamente SNRPN locus (snoRNA
  cluster), necdina, PAR1, PAR5, PAR7
• Geni espressi maternamente UBE3A

(K.O. e studio di mutazioni)
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• SNRPN

UBE3A

• Maturazione mRNA
• 10 esoni
• SNRPN locus gt 460kb
• Espressione monoallelica nel cuore (feto) e nel
  cervello (feto e adulto).

• Ubiquitina transferasi
• 10 esoni
• Locus gt 60kb
• Espressione monoallelica (cervello).

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Prader-Willi (PWS)/Angelman syndrome (AS)

• Cromosoma 15q11-q13 (mouse 7C-D1)

PWS (MIM 176270)
AS (MIM 105830)

• Ritardo mentale
• Obesità
• Ipotonia muscolare
• Ridotta attività fetale
• Bassa statura
• Ipogonadismo

• Ritardo mentale
• Ritardo motorio
• Atassia
• Epilessia
• Absence of speech
• Facies tipica

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UBE3A
SNRPN
tel
cen
Angelman syndrome
UBE3A
SNRPN
tel
cen
Prader-Willi syndrome
Modifiche epigenetiche
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ICR (Impriniting Control Region) nella PWS/AS

• PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1

• AS-SRO (0,88Kb), 35Kb upstream SNRPN promoter

Fig.1a pubblicazione di Perk
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• AS-SRO e PWS-SRO costituiscono un imprinting
  box che regola lintero dominio 15q11-q13 su
  entrambi i cromosomi

Modifiche epigenetiche allele-specifiche
AS-SRO sul chr paterno
PWS-SRO sul chr materno
UBE3A non espresso
SNRPN non espresso
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Caratteristiche epigenetiche della
AS-SRO.Livelli di metilazione allelica
ER Southern blot
AS
AS
Met
A differenza di quanto atteso, i livelli di
metilazione della AS-SRO è simile in entrambi gli
alleli
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Osservazioni

• Forse il livello di metilazione della AS-SRO non
  costituisce un meccanismo chiave nellimprinting

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Caratteristiche della cromatina
AS-SROaccessibilità alla Dnasi I.
Dnasi I

• Accessibilità maggiore nel locus materno.

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Caratteristiche epigenetiche differenziali.

• Metilazione H3(K4) e acetilazione H3 e H4
  maggiori a livello materno

ChIP assay
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Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO

• Struttura cromatinica più accessibile sul
  cromosoma materno

• Metilazione materna H3 (K4)

• Acetilazione materna H3 e H4

Espressione genica allele-specifica
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SNURF-SNRPN gene locus

• PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1

• ChIP assay

(Ab anti-acetylated H3 e H4 histone)

• PCR

Acetilazione istonica (espressione genica)
Deacetilazione istonica
Prodotto di PCR
Prodotto di PCR
Cromosoma paterno
Cromosoma materno
26
ChIP assay
SNRPN

• Lacetilazione istonica H3/H4 è limitata alla
  regione 5 del locus SNURF-SNRPN

CpG island
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Relazione tra acetilazione istonica e metilazione
della CpG island del locus SNURF-SNRPN

• Copia attiva del gene

Copia inattiva del gene (imprinted)

• Acetilazione istonica

• Acetilazione istonica

• Metilazione

• Metilazione

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Relazione tra acetilazione istonica e metilazione
della CpG island del locus SNURF-SNURP

• ChIP assay

Ab anti-acetylated H3 e H4 histone

• M-PCR amplificazione del DNA non metilato

Deacetilazione istonica
Acetilazione istonica
Prodotto di M-PCR
No prodotto di M-PCR
Cromosoma paterno
Cromosoma materno
29
Relazione tra acetilazione istonica e metilazione
della CpG island del locus SNURF-SNURP

• La copia attiva del gene (paterna) è
  caratterizzata da acetilazione istonica e
  metilazione

ChIP assay e M-PCR
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Conclusioni

• AS-SRO (copia materna, trascrizionalmente attiva)

PWS-SRO (copia paterna, trascrizionalmente attiva)

• Suscettibilità alla DNAsi I
• Acetilazione istonica H3-H4
• Metilazione istonica H3(K4)
• Metilazione CpG island.

• Suscettibilità alla DNAsi I
• Acetilazione istonica H3-H4
• Metilazione istonica H3(K4)

Modifiche epigenetiche che garantiscono
lespressione allelica differenziale
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Esiste uninfluenza della AS-SRO
PWS-SRO?
PWS
AS
ERSouthern blot
Met

• La delezione della AS-SRO, esclusivamente a
  livello materno, è in grado di influenzare lo
  stato di metilazione della PWS-SRO

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Caratteristiche strutturali della cromatina nella
PWS-SRO

• La delezione materna della AS-SRO rende la
  PWS-SRO materna accessibile alla Dnasi I

AS
Dnase I assay Southern blot
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Modifiche epigenetiche differenziali della
PWS-SRO
La delezione materna della AS-SRO influisce
considerevolmente sullla metilazione istonica del
locus PWS-SRO, mentre è ininfluente
sullacetilazione istonica.
ChIP assay
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Influenza della AS-SRO sulla PWS-SRO

• La presenza della AS-SRO sul cromosoma materno
  interviene nei meccanismi di imprinting che
  agiscono sulla PWS-SRO.

Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO

• Lassenza della PWS-SRO, sia materna che paterna,
  non influisce
• Sul tasso di metilazione della AS-SRO
• Sulla suscettibilità della AS-SRO alla DNasiI
• Sul tasso di acetilazione istonica a livello
  della AS-SRO.

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Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO
ERSouthern blot

• Dnasi I assay

ChIP assay
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Conclusioni

• La AS-SRO materna ha un ruolo importante nel
  determinare una struttura cromatinica chiusa
  della PWS-SRO materna (DNasiI/ChIP).
• Lattività della AS-SRO sulla PWS-SRO non è
  lunico meccanismo in grado di sostenere
  limprinting della PWS-SRO (acetilazione
  istonica).

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Conclusioni

• La AS-SRO probabilmente acquisisce unespressione
  differenziale prima della PWS-SRO

Gli oociti subiscono metilazione differenziale
durante la loro maturazione
Entrambi i tipi di gameti non presentano
metilazione della PWS-SRO