INTRODUCCIУN A LA MICROBIOLOGНA CLНNICA

1
INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
2
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

• Diagnósticos etiológicos preliminares.
• Utilización racional de las técnicas
  diagnósticas.
• Correcta obtención de muestras.
• Fundamentos de técnicas y métodos diagnósticos.
• Evaluación correcta de los resultados.

3
MISIÓN DE UN SERVICIO DE MICROBIOLOGÍA

• Información necesaria para tomar una decisión
  clínica y adopción de medidas preventivas.
• Normas de obtención de muestras para un correcto
  diagnóstico microbiológico.
• Identificación de microorganismos.
• Estudio de sensibilidad a antimicrobianos.
• Facilitar recepción de muestras.
• Envio rápido de resultados.
• Valoración de las técnicas diagnósticas.
• Puesta al día de los conocimientos.

4
FASES DEL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

• Fase preanalítica
• Proveer información sobre recogida/transporte y
  conservación de las muestras.
• Interpretación de los resultado.
• Utilización de la prueba.
• Fase análítica
• Producir resultados de calidad.
• Fase postanalítica
• Revisar exactitud del resultado.
• Evaluar la relevancia clínica.

5
NO PIDAS NADA QUE SI ES POSITIVO, NO SEPAS QUE
HACER
6
UTILIZACIÓN DE UNA TÉCNICA DIAGNÓSTICA

• Valoración previa de que un paciente presente o
  no la enfermedad.
• Planteamiento inicial antes de solicitar una
  prueba diagnóstica de cual va a ser nuestra
  actitud y decisión después del resultado de la
  misma.
• Conocimiento de la eficacia de una prueba a
  utilizar.

7
NORMAS GENERALES PARA LA TOMA DE MUESTRAS
CLÍNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS EE.II.

• La muestra debe ser representativa del cuadro
  clínico.
• Debe obtenerse antes de la instauración del
  tratamiento antimicrobiano.
• En determinados procesos infecciosos (p. ej.
  septicemia) el momento de la obtención puede ser
  importante.
• Debe transportarse rápida y adecuadamente al
  laboratorio.
• Debe rotularse correctamente y venir acompañada
  de una orientación o juicio clínico que permita
  realizar las técnicas adecuadas al microorganismo
  sospechado.

8
MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO TIPOS

• Muestras de obtención directa de localizaciones
  estériles. Alta rentabilidad.
• Muestras de obtención indirecta de localizaciones
  estériles. Rentabilidad dependiente de la flora
  saprofita.
• Muestras obtenidas de localizaciones con flora
  microbiana.
• Muestras para el diagnóstico virológico. Alta
  rentabilidad por ausencia de flora viral.

9
PRINCIPALES MUESTRAS CLÍNICAS PARA AISLAMIENTO DE
VIRUS
10
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS

• Métodos directos
• Visualización del microorganismo.
• Aislamiento del microorganismo.
• Detección de antígenos.
• Detección de metabolitos, componentes y ácidos
  nucleicos.
• Métodos indirectos
• Detección de anticuerpos D. Serológico.
• Detección Respuesta Inmune Celular.

11
PRINCIPALES TÉCNICAS MICROSCÓPICAS USADAS PARA LA
VISUALIZACIÓN DE MICROORGANISMOS EN MUESTRAS
CLÍNICAS
12
VISUALIZACIÓN DEL MICROORGANISMO

• Microscopía diferentes tipos
• Examen en fresco
• Tinciones
• Tinción de Gram
• Tinción de Ziehl-Neelsen

13
TINCIÓN DE GRAM APLICACIONES

• LCR y otros fluidos estériles
• Esputo
• Exudado uretral
• Exudado vaginal
• Exudados inflamatorios
• Orina

14
INFORMACIÓN QUE APORTA UNA TINCIÓN DE GRAM EN
MUESTRAS CLÍNICAS (EXUDADOS INFLAMATORIOS Y
FLUIDOS ESTÉRILES)

• Permite evaluar la calidad de la muestra.
  Presencia de
• Células inflamatorias ? muestra adecuada
• Células epiteliales ? posible contaminación
• Permite visualizar la morfología, su disposición
  y localización intra o extracelular de las
  bacerias
• Permite diferencias bacterias Gram y Gram
• Permite detectar la presencia de flora
  contaminante
• Permite cuantificar el número de bacterias

15
AISLAMIENTO DEL MICRORGANISMO

• Cultivo en medios artificiales
• Nutritivos
• Selectivos
• Diferenciales
• Cultivos celulares
• C. de órgano C. primarios
• C. secundarios Línea celular
• Inoculación animal

16
CARACTERÍSTICAS UTILIZADAS PARA LA IDENTIFICACIÓN
DE BACTERIAS

• Crecimiento en distintos medios de cultivo
• Características bioquímicas
• Producción de toxinas
• Estructura antigénica
• Estructura genómica

17
DETECCIÓN DIRECTA DE ANTÍGENOS MEDIANTE TÉCNICAS
DE AGLUTINACIÓN

• Antígenos bacterianos
• H.influenzae
• S.pneumoniae
• N.meningitidis
• Antígenos fúngicos
• C.neoformans
• Antígenos víricos
• Rotavirus
• Adenovirus

18
DETECCIÓN DIRECTA DE ANTÍGENOS MEDIANTE TÉCNICAS
DE ELISA

• Antígenos bacterianos
• S.pyogenes
• L.pneumophila
• C.trachomatis
• C.difficile (toxina)
• Antígenos fúngicos
• C.neoformans
• A.fumigatus

• Antígenos víricos
• Adenovirus
• Herpesvirus
• V.respiratorio sincitial
• Rotavirus
• Antígenos parasitarios
• G.lamblia
• C.parvum
• E.histolytica

19
VENTAJAS DE LAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

• Sensibilidad extrema (detectan hasta 1-10
  microorganismos)
• Alta especificidad (diseño de cebadores en
  función de secuencias específicas del
  microorganismo)
• Rapidez de realización (máximo 24 horas)
• Detección de microorganismos viables y no viables
• Automatizables

20
INCONVENIENTES DE LAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

• Posibles falsos positivos
• Acondicionamiento especial del laboratorio
• Alto nivel de entrenamiento del personal
• Elevado coste inicial

21
VENTAJAS DE LA DETECCIÓN RÁPIDA DE LA RESISTENCIA
MEDIANTE TÉCNICAS MOLECULARES

• Reducir el tiempo requerido para instauración
  tratamiento definitivo
• Evitar tratamientos incorrectos
• Detección de portadores infectados con
  microorganismos resistentes
• Reducción de costes y tiempo de estancias
  hospitalarias

22
INCONVENIENTES DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES DEN LA
DETECCIÓN DE RESISTENCIAS

• Desconocimiento de la secuencia del gen/es
  implicados
• Casos con múltiples genes implicados
• Diferente grado de expresión de los genes en
  condiciones ambientales diferentes
• Los microorganismos de la flora saprofita poseen
  también genes de resistencia

23
DIAGNÓSTICO MEDIANTE BIOCHIPS-MICROARRAYS

• Se fundamenta en una técnica de afinidad
  utilizando sondas de ácidos nucleicos para
  hibridación soportadas en un chip.
• Es una aplicación de la Bioinformática.
• Un microarray es una herramienta para analizar la
  expresión de los genes que consiste en una
  membrana o vidrio que contiene adheridos muchos
  genes dispuestos de una forma organizada
  predeterminada.

24
Un esperimento con Microarrais de ADN
25
DETERMINACIONES SEROLÓGICAS BASADAS EN LA
REACCIÓN PRIMARIA

• Inmunofluorescencia
• Directa
• Indirecta
• Mediada por complemento
• Radioinmunoanálisis
• Enzimainmunoanálisis
• ELISA tipo1
• ELISA tipo2
• ELISA tipo3 (captura)

26
DETERMINACIONES SEROLÓGICAS BASADAS EN LA
REACCIÓN SECUNDARIA

• Precipitación
• Medio sólido
• Medio líquido
• Aglutinación
• Directa
• Hemaglutinación
• Látex
• Fijación de complemento

27
DETECCIÓN DE RESPUESTA INMUNE CELULAR

• Pruebas cutáneas
• Activación linfocitaria
• Inhibición de los macrófagos
• Linfotoxicidad

28
PARÁMETROS DE UNA TÉCNICA DIAGNÓSTICA

• Sensibilidad
• Especificidad
• V.P.Positivo
• V.P.Negativo
• Eficiencia
• Relevancia clínica

• Verdadero positivo
• Verdadero negativo
• Falso positivo
• Falso negativo

29
SENSIBILIDAD (S)
Verdadero positivo (VP)
X 100
S
(VP) Falso negativo (FN)
ESPECIFICIDAD (E)
Verdadero negativo (VN)
E
X 100
(VN) Falso positivo (FP)
30
EFICIENCIA
VP VN
X 100
Total
31
VALOR PREDICTIVO POSITIVO (VPP)
(VP)
X 100
VPP
(VP) (FP)
VALOR PREDICTIVO NEGATIVO (VPN)
(VN)
VPN
X 100
(VN) (FN)
32
VALOR PREDICTIVO DE UNA PRUEBA CON UN 95 DE S. Y
UN 95 DE E. VARIACIONES EN FUNCIÓN DE LA
PREVALENCIA DE LA ENFERMEDAD

• Prev. Enfermedad ()

• Valor Predictivo ()

• 1
• 2
• 5
• 10
• 15
• 20
• 25
• 50

• 161
• 279
• 50
• 679
• 77
• 826
• 864
• 95

33
FLORA MICROBIANA NORMAL IMPORTANCIA DE SU ESTUDIO

• Detección de alteraciones cualitativas
  disbacteriosis.
• Detectar alteraciones cuantitativas.
• Conocer microorganismos que pueden infectar zonas
  determinadas.
• Conocer origen y significación de determinados
  aislamientos.

34
TIPOS DE FLORA MICROBIANA

• Flora residente.
• Flora transitoria.

35
FUNCIONES FLORA MICROBIANA VENTAJAS

• Efecto sobre la digestión/nutrición.
• Biotransformación de ácidos biliares y colesterol
• Producción de nutrientes y vitaminas K, E, B12,
  ácido fólico.
• Interferencia microbiana.
• Estimulación de los mecanismos de defensa.

36
FUNCIONES FLORA MICROBIANA INCONVENIENTES

• Facilitar colonización de otras especies.
• Infecciones endógenas.
• Reservorio de resistencias a antimicrobianos.
• Papel de la flora en pacientes hospitalizados.

37
FLORA MICROBIANA DE LA PIEL

• S. epidermidis y otros ECN.
• Propionibacterium spp.
• Clostridium spp.
• Corynebacterium spp.
• Levaduras.

38
FLORA MICROBIANA NASOFARINGE Y OROFARINGE

• Fosas nasales
• Flora cutánea S. aureus (25-30)
• Nasofaringe
• Flora oral
• N.meningitidis
• S.pneumoniae
• H.influenzae
• M.catharralis
• Orofaringe
• Flora nasofaríngea
• Estreptococos alfa hemolíticos
• Neisseria saprofitas

39
FLORA MICROBIANA CAVIDAD ORAL (I)

• Cocos Gram positivos
• Estreptococos alfa y no hemolíticos (30-50 del
  total)
• S. mutans y S. sanguis dientes
• S. Salivarius lengua
• Cocos Gram negativos
• Veillonella spp. (Actualmente se considera que
  existen 600 especies diferentes)

40
FLORA MICROBIANA CONJUNTIVA

• S. epidermidis (50-90)
• Corynebacterium spp (20-75)
• Propionibacterium spp (50)

41
FLORA MICROBIANA DEL APARATO DIGESTIVO

• Esófago
• Flora deglutida
• Estómago
• Casi estéril en condiciones normales (pH)
• Intestino delgado
• 103 (duodeno) a 108 bac/ml (ileon)
• Predominan Gram enterococos, difteroides,
  Lactobacillus spp.
• Al descender R a bilis enterococos, bacteroides
  y enterobacterias (Proteus)I

42
FLORA MICROBIANA INTESTINO GRUESO

• Número 108 1011 bac/ml a 1012 ml/heces
• Efecto de la dieta
• Composición
• 96-99 anaerobios
• Bacteriodes spp (grupo fragilis)
• Fusobacterium spp
• Clostridium spp
• 1-4 aerobios facultativos
• Enterococos
• Enterobacterias ( E. Coli)

43
GENEROS BACTERIANOS PRESENTES EN LA FLORA DEL
INTESTINO GRUESO (I)BACILOS ANAEROBIOS

• Gram neg.
• Bacteroides
• Fusobacterium
• Porphyromonas
• Leptotrichia
• Butyrivibrio
• Campylobacter
• Desulfomonas
• Succinomonas
• Succinivibrio
• Lachnospira
• Cytophaga

44
GENEROS BACTERIANOS PRESENTES EN LA FLORA DEL
INTESTINO GRUESO (II)BACILOS ANAEROBIOS

• Gram pos.
• Actinomyces
• Arachnia
• Propionibacterium
• Bifidobacterium
• Eubacterium
• Lactobacillus
• Clostridium
• Bacillus

45
GENEROS BACTERIANOS PRESENTES EN LA FLORA DEL
INTESTINO GRUESO (III)BACILOS GRAM NEGATIVOS

• Facultativos
• Escherichia
• Klebsiella
• Proteus
• Morganella
• Enterobacter
• Citrobacter
• Vibrio
• Pseudomonas

46
GENEROS BACTERIANOS PRESENTES EN LA FLORA DEL
INTESTINO GRUESO (IV)
47
FLORA MICROBIANA DEL APARATO GENITOURINARIO

• Uretra anterior Flora perineal
• Estafilococo coagulasa negativo
• Estreptococos no hemolíticos
• Corynebacterium spp
• Lactobacillus spp
• Vagina
• Prepuberal y postgmenopaúsica mixta (piel
  colon)
• Posgtpuberal
• Lactobacillus spp
• Bifidobacterium spp
• Peptostreptococcus spp
• Bacteroides spp
• Levaduras

48
TIPOS DE MICROORGANISMOS A LOS QUE ES APLICABLE
LA DETECCIÓN M EDIANTE TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

• No cultivadas
• De crecimiento lento
• Carfentes de métodos de diagnóstico eficaces
• De manejo peligroso
• Cultivos muy costosos

49
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO UTILIZACIÓN

• Agente causal
• No cultivable
• Peligroso su cultivo
• Crecimiento lento
• Cambiar el diagnóstico o el tratamiento
• Comprender el proceso de la enfermedad
• Beneficio al paciente o a otros