DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI

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DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI

• Enrico Tortoli

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La tubercolosi

• nel MONDO
• 2.000.000 morti allanno
• 8.000.000 nuovi casi allanno
• 1/3 della popolazione mondiale infettato
• in ITALIA
• 4.287 casi notificati nel 2001

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Infezione da M. tuberculosis

• Malattia tubercolare
• se il sistema immunitario non riesce a
  controllare linfezione
• Infezione latente (assenza di malattia)
• se linfezione rimane sotto il controllo del
  sistema immunitario

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M. tuberculosis, infezione
Esposizione al M. tuberculosis
Assenza di infezione (5)
TBC attiva (5) (entro 2 anni)
Infezione (95)
Riattivazione (5)
TBC latente (95)
nessuna riattivazione (90)
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Risposta immune allinfezione tubercolare
Risposta
ICM
Moltiplicazione batterica
Anticorpi
Tempo
infezione
malattia
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I linfociti T

• Cellula-T nativa non venuta in contatto con
  lAg
• Cellula-T effettrice cellula-T nativa venuta in
  contatto con lAg
• Cellula-T memoria cellula effettrice dopo
  lallontanamento dellantigene
• Cellula-T effettrice cellula-T memoria in
  occasione di un nuovo contatto con lAg

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La Mantoux

• Introdotta nel 1890, è il più vecchio test
  diagnostico ancora in uso
• Si basa sullinoculo intradermico del PPD,
  (miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni
  dei quali sono presenti anche nel BCG e nei
  micobatteri non tubercolari)

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Mantoux
Linfocita T
Cellula presentante lAg
Rilascio di IFN-?, TNF e IL8
richiamo e attivazione cellulare
indurimento e arrossamento nel punto
delliniezione
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Punti di forza della Mantoux

• Utile per predire la TBC attiva
• Il trattamento dei soggetti Mantoux-positivi
  riduce drasticamente il rischio di passaggio alla
  tubercolosi attiva
• Basso costo
• Non richiede lintervento del laboratorio

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Limiti della Mantoux

• Falsi positivi
• 5-60 dei vaccinati
• Tempo trascorso dalla vaccinazione
• Numero di vaccinazioni
• Età al momento della vaccinazione
• - Esposizione a micobatteri non tubercolari
  (NTM)
• - Effetto booster
• Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con
  tubercolosi avanzata)
• Falsi negativi
• Errori di inoculo
• Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza
  della misurazione)
• Problemi di ordine pratico
• Doppia presentazione del paziente
• Mancata lettura nel 30 dei casi

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Produzione di interferone-? (IFN-?)

• Linfezione tubercolare stimola la risposta della
  cellule T
• Le cellule-T attivate secernono citochine
• IFN-?
• TNF
• IL8
• Le cellule-T effettrici producono IFN-? entro
  poche ore dalla stimolazione
• Le cellule-T memoria devono prima proliferare
  trasformandosi in cellule effettrici, non sono
  quindi in grado di produrre IFN-? prima di 24h
• LIFN-? non è normalmente presente in circolo, è
  stabile e misurabile

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I test basati sullinterferone-?

• I linfociti del soggetto in esame vengono posti
  in contatto con lantigene, con un controllo
  negativo privo di antigene e con un controllo
  positivo contiene fitoemoagglutinina
• Ricerca dellIFN-? dopo opportuna incubazione
• assenza di IFN-? ASSENZA DI INFEZIONE
• presenza di IFN-? INFEZIONE
• presenza di IFN-? nel controllo NEG TEST NON
  VALIDO
• assenza di IFN-? nel controllo POS DEFICIT
  IMMUNITARIO

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La scelta degli antigeni

• I linfociti T dei soggetti con infezione
  tubercolare producono interferone-? se vengono in
  contatto con uno o più antigeni del M.
  tuberculosis
• PPD (purified proteic derivative)
• ESAT-6 (early secretory antigenic target 6)
• CFP-10 (culture filtrate protein 10)
• ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione
  genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i
  MNT

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Specificità di ESAT-6 and CFP-10
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Metodo ELISA
ESAT-6
CFP-10
Mitogeno
K -
Incubazione overnight a 37oC Se sono presenti
cellule-T effettrici viene secreto IFN-g
Sangue eparinato
Trasferimento in pozzetti e aggiunta dellantigene
DO 450nm
IFN-g IU/ml
Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura
Recupero del plasma e dosaggio dellIFN-? (sandwi
ch ELISA, incubazione 120 min)
Misura della DO e dosaggio dellIFN-g contro una
curva di taratura
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Metodo ELISA in-tube
Raccolta del sangue in provette eparinate
Incubazione per 16-24h a 37C
K neg ESAT6 CFP10 mitogeno
centrifugazione
DO 450nm
Recupero del plasma e dosaggio dellIFN-? (sandwi
ch ELISA, incubazione 120 min)
IFN-g IU/ml
Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura
Misura della DO e dosaggio dellIFN-g contro una
curva di taratura
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Metodo ELISpot
ESAT-6
CFP-10
Mitogeno
K -
Separazione e conteggio dei leucociti mononucleati
Sangue eparinato
Trasferimento dei linfociti (250.000 cell.) in
pozzetti coated con Ab anti-IFN-? e aggiunta
dellantigene
Conteggio degli spot, al microscopio o
con lettore automatico
Lavaggio e dosaggio dellIFN-? (sandwich ELISA,
incubazione 120 min)
Incubazione overnight a 37oC
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Metodo ELISpot lettura

• Man mano che una cellula secerne IFN-? questo
  viene legato dagli Ab sottostanti, si forma
  quindi uno spot
• POSITIVO quando si hanno spot con almeno uno
  degli antigeni
• se il K- ha 0-4 spot ed il pozzetto dellAg ha
  più di 5 spot
• se il K- ha gt5 e lt10 spot ed il pozzetto con
  lantigene ha un numero di spot almeno doppio
• NON VALIDO se K- gt10 spot e/o K lt20 spot

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Vantaggi dei metodi basati su IFN-?

• Test in vitro
• Nessun effetto booster
• Specificità elevata
• Non influenzati dalla vaccinazione con BCG
• Praticità occorre solo un prelievo di sangue e
  non è richiesta la collaborazione del paziente
• Interpretazione oggettiva
• Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari

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Valutazione clinica dei test basati su IFN-?

• Non esiste un gold standard per la tubercolosi
  latente
• La sensibilità del test viene solitamente stimata
  in soggetti con tubercolosi attiva, usando la
  coltura come gold standard
• La specificità viene solitamente stimata in
  soggetti ad alto rischio

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La risposta IFN-? ad ESAT-6/CFP-10 è predittiva
del passaggio a TBC attiva?

• La risposta IFN-? correla con lesposizione
• Circa il 90 dei pazienti risponde
• In Etiopia, un follow up di 2 anni di contatti
  conviventi col caso indice, ha dimostrato la
  correlazione della risposta ad ESAT-6 (ma non al
  PPD) con la progressione verso la malattia
• Doherty et al (JCM 2002)

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Correlazione IFN-?/Mantoux
Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004
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Test IFN-? vs. Mantoux

• Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva
  SOVRAPPONIBILE
• Sensibilità nei casi di sospetta infezione
  latente MAGGIORE per IFN-?
• I casi con Mantoux NEG e IFN-? POS sono
  generalmente associati con lesposizione
• I casi con Mantoux POS e IFN-? NEG non sono
  generalmente associati con lesposizione

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IFN-? e gruppi di rischio
AJRCCM, Mori, 2004
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Studio dei contatti

• Caso indice uno studente di una scuola danese
• Stratificazione dei contatti
• Soggetti che cantavano nello stesso coro del caso
  indice
• Compagni di classe
• Altri studenti della scuola
• Forte correlazione della risposta IFN-? con
  lesposizione
• Forte correlazione della Mantoux con la
  vaccinazione

AJRCCM Brock , 2004
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Studio dei contatti

• Caso indice una partoriente in un ospedale
  italiano
• Stratificazione dei contatti
• Ricoverate nella stessa stanza
• Neonati
• Visitatori
• Positività al test a base di IFN-? fortemente
  correlata con lesposizione
• Mantoux quasi sempre negativa

AJRCCM Richeldi, 2004
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Altri studi

• Nessuna correlazione con la vaccinazione
• Nessuna correlazione con le micobatteriosi
• Nessuna variazione in corso di terapia
• Alta riproducibilità
• Maggior sensibilità negli immunodepressi

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Da approfondire

• Sensibilità negli immunodepressi
• Sensibilità nei bambini
• Sensibilità nella tubercolosi extrapolmonare
• Utilità nel monitoraggio della terapia
• Specificità nei pazienti con micobatteriosi

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ATS soggetti da testare

• Soggetti con fibrosi polmonare
• Soggetti provenienti da paesi ad alta endemia (in
  particolare se arrivati da meno di un anno)
• Soggetti appartenenti a categorie sociali
  particolari (senza fissa dimora, carcerati)
• Operatori sanitari
• Contatti stretti (gt 4h/settimana) di soggetti con
  tubercolosi
• HIV-positivi
• Soggetti con Mantoux-conversione recente (lt 2
  anni)
• Pazienti affetti da silicosi, neoplasie
  ematologiche, tossicodipendenti, immunosoppressi