PREIMPLANTASYON GENETIK TANI

1
PREIMPLANTASYON GENETIK TANI

• Hazirlayan E. Sacide ÇAGLAYAN

2

• Genetik Bir Hastalik Için Risk Tasiyan Çift
• Noninvazif Prenatal Tani
• Ultrasonografi,ITT, ÜTT, Maternal AFP Testi
• Invazif Prenatal Tani
• CVS, Amniyosentez, Kordosentez,
• Preimplantasyon Genetik Test Sistemleri (PGT)
• Prenatal genetik tani (PGD), Prenatal genetik
  tarama (PGS)

3

• PGT, genetik açidan hastalikli çocuk sahibi olma
  riski çok yüksek aileler için konvansiyonel
  prenatal tani yöntemlerinden daha avantajli bir
  uygulamadir.
• Gebelik öncesinde, yardimci üreme teknikleri ile
  elde edilen embriyolarin genetik analizinin
  yapilmasi esasina dayanir.

4
PGT

• PGD
• Basvuran çift etkilenmistir (kendisinde ve
  ailesinde genetik hastalik bulunur)
• PCR, FISH,CGH
• PGS
• Basvuran çift etkilenmemistir
• FISH

5
(No Transcript)
6
Tarihçe

• 1968 yilinda, Edwards ve Gardner, ilk ebriyo
  biyopsisini tavsanlar üzerinde denemistir.
• Insanlarda, ilk PGD denemesi 80li yillarin
  ortalarinda, prenatal tani yöntemlerine
  alternatif olarak gelistirilmistir.
• Baslangiçta, PGD, Xe bagli kalitimi önlemek için
  cinsiyet belirlenmesi ile ilgilenmistir.
• 1989da Handyside ve ekibinin uyguladigi, Xe
  bagli kalitilan bir hastalik için ilk PGD
  denemesi ile saglikli bir dogum
  gerçeklestirilmistir.

7

• 2006 yilina kadar,15.000den fazla PGD uygulamasi
  rapor edilmistir.
• Günümüzde PGD ile, bir çok genetik mutasyon
  belirlenebilmektedir.
• PGD, günümüzde saglam bir sekilde
  uygulanabilmektedir ancak PGS hala yeni, yavas
  yavas gelisen ve tartisilan bir yöntemdir.

8
PGDnin Önemi

• Genetik bir hastaligi kalitma riski çok yüksek
  olan çiftlere uygulanir.
• Sadece etkilenmemis ve saglikli embriyolarin
  uterusa transferi yapildigindan erken veya geç
  dönemde yasanan abortus veya gebeligin
  sonlandirilmasi gibi travmatik durumlar
  önlenmektedir.

9

• PGD 3 temel hastalik grubu için önerilmektedir.
• 1) Cinsiyete bagli kalitilan hastaliklar
• 2) Tek gen hastaliklari
• 3) Kromozomal Düzensizlikler
• Günümüzde multifaktöriyel hastaliklara ve
  nonmendeliyen hastaliklara yönelik PGD
  uygulamalari de yapilabilmektedir

10
Cinsiyete Bagli Kalitilan Hastaliklar

• Xe bagli kalitilan hastaliklarin bir sonraki
  nesle aktarilmasindan tasiyici bir anne
  sorumludur.
• Tasiyici anne, anormal X kromozomunu erkek
  çocuguna aktardiginda hastalik ortaya çikar,
  çünkü babadaki normal Xin geçisi olmaz.
• Etkilenmis babanin erkek çocuklarinin tamami
  normal olurken, kiz çocuklari tasiyici olur.
• Hemofili, frajil X ve birçok musküler distrofi
  (resesif)
• Rett sendromu ve psödohiperparatiroidizm
  (dominant)

11
Tek Gen Hastaliklari

• Bu tip hastaliklarin tanimlanmasinda, PCR temelli
  moleküler teknikler uygulanmaktadir.
• En önemli sorunlardan biri çok sayida mutasyon
  içeren hastaliklarin analizinde yasanmaktadir.
• Birçok nadir mutasyon rutin olarak çalisilamamkta
  ve klinik belirtisi olmayan bir çiftin tasiyici
  olma riski bulunmaktadir
• Kistik Fibroz (CF), Tay-Sachs, Orak Hücre Anemisi
  ve Huntington
• BRCA-1 (spesifik bir hastalik nedeni degil ancak
  bir grup hastalik için risk artisina yol açan
  mutasyonlar)

12
PGT Tek gen hastalilari
OTOZOMAL RESESSIF Kistik fibrozsis (various
mutations) Tay Sachs hastaligi ?-talassaemi Orak
hüreli anemi Rh grubu tayini Spinal müsküler
atrofi Adrenogenital sendrom Konjential adrenal
hiperplazi Epidermolizis bülloza Gaucher
hastaligi Fanconi anemisi HLA uyumu Üçlü tekrar
hastaliklari Frajile X Miyotonik
distrofi Huntington hastaligi

• OTOZOMAL DOMINANT
• Marfan sendromu
• Charcot-Marie Tooth hastaligi (type 1A)
• Crouzons sendromu
• NF2
• Osteogenesis impeerfekta I and IV
• Stickler sendromu
• Tuberoz skleroz
• Familyal adenomatöz polypozis koli
• Li Fraumeni sendromu
• Retinoblastoma
• Xe bagli
• Lesch Nyhan sendromu
• Duchenne kas distrofisi
• Charcot-Marie Tooth hastaligi
• Retinitis pigmentoza
• Ornitin Transkarbamilaz
• Hemofili

13
Kromozomal Düzensizlikler

• Translokasyon, delesyon, insersiyon gibi yapisal
  düzensizlikler Floresans In Situ Hibridizasyon
  (FISH) teknigi ile belirli bir lokusa spesifik,
  telomerik problar kullanilarak belirlenmektedir
• Bazi çiftler, PGD uygulanmadan, kendiliginden
  olusan bir gebelikle çocuk sahibi olamamaktadir,
  çünkü önceki konsepsiyonlarda dengesiz kromozomal
  düzensizlik spontan düsüklere yol açmaktadir.

14
PGS ve Endikasyonlari

• Yüksek risk tasiyan hastalarda anöploidi
  taramalari amaciyla yapilir.
• PGS için gerekli endikasyonlar
• Ileri maternal yas
• Tekrarlayan gebelik kaybi öyküsü
• Tekrarlayan IVF basarisizligi
• Infertilitede erkege bagli faktörler

15
PGS

• Embriyoda anöploidi riski, anne 35-39 yas
  arasinda ise 20den daha yüksekken, 40 yas ve
  üzerinde yaklasik 40 civarindadir.
• Bu tip olgularin birçogu, gebelikten
  kuskulanmadan önce kaybedildigi için fark
  edilememektedir
• PGS uygulamasi ile saglikli gebelik olusma
  ihtimali artarken, düsük veya etkilenmis embriyo
  olusumu riski düsmektedir.

16
PGD ve Cinsiyet Belirlenmesi

• Kültürel, etnik, sosyal ve psikolojik nedenlerden
  dolayi, bazi durumlarda arzu edilen cinsiyette
  çocuk sahibi olmak için PGDden yardim almayi
  taleb eden çiftler olabilmektedir.
• Bu tip uygulamalara yaklasim toplumdan topluma
  degisebilmekle birlikte hala yogun olarak
  tartisilmaktadir.

17
PGTnin ASAMALARI

• 1) IVF
• 2) TEK HÜCRE BIYOPSISI
• 3) GENETIK TESTLER
• 4) EMBRIYO TRANSFERI

18
IVF

• Ovaryan Stimulasyon
• Foliküler Aspirasyon
• Maturasyon Için Bekleme
• Intrasitoplazmik Sperm Injeksiyonu (ICSI)
• Fertilizasyon Sonrasi Embriyonik Gelisim Için
  Kültür Süreci

19
(No Transcript)
20
(No Transcript)
21
TEK HÜCRE BIYOPSISI

• Polar body biyopsisi
• Yariklanma asamasinda embriyo biyopsisi
• Blastosit biyopsisi

22
Ilk gün
Insan Oositi Hazirlanmis Sperm
23
Intrasitoplazmik Sperm Injeksiyonu(ICSI)
24
2. gün
2 hücreli embriyo
4 hücreli embriyo
25
3. Gün

• 8 hücreli embriyo (72 saat)
• Yariklanma asamasinda biyopsi (blastomerler)

26
5/6. günler

• Blastosist
• Biyopsi ?

27
Blastomer biyopsisi (3.gün)
Kutup cismi biyopsisi
28
PGDDE KULLANILAN GENETIK TESTLER

• PCR
• FISH
• CGH

29
PCR (DNA Amplifikasyonu)

• Genellikle, dominant veya resesif hastaliklari
  kapsayan tek gen defektlerinin belirlenmesinde
  kullanilmaktadir.
• DNA molekülü, nükleotid bazlara ve primere
  tutunmayan DNA polimeraz enzimi içeren bir
  solusyonla muamele edilir.
• Yüksek isida DNA iplikleri arasindaki baglar
  yikilir. Isi düsürüldügünde, DNA polimeraz
  serbest nükleotid bazlari primere baglayarak
  hizli bir sekilde yeni iplikler sentezler.
• Iki primer arasindaki boslugun tamamlanmasi ile
  yeni bir iplik sentezlenmis olur.
• Bu islemin defalarca tekrarlanmasi ile, birkaç
  saat içinde DNAnin küçük bir kisminin
  milyarlarca kopyasi olusturulmaktadir.

30
(No Transcript)
31
(No Transcript)
32
(No Transcript)
33
(No Transcript)
34

• Bu yöntem bir çok PGT protokolünde yer
  almaktadir.
• Burada, yeterli miktarda ve yüksek kalitede saf
  DNA molekülü elde etmek gerekir ve bazi
  durumlarda polar body ve blastomer gibi tek bir
  hücrede bunu gerçeklestirebilme hususunda
  güçlükler yasanabilir
• Allelik dropout ve laboratuvar kontaminasyonu da
  yasanabilecek önemli komplikasyonlardir.
• PGDde tek bir hücre amplifiye edilmelidir.
• ICSI isleminde maternal ve paternal kaynakli
  kontaminasyonun mümkün oldugunca önlenmesi
  gerekmektedir.

35

• PCRdan kaynaklanan hatalar, etkilenmis bir
  embriyonun transferi veya normal bir embriyonun
  fark edilememesine neden olabilir (Ör allelik
  dropout).
• Otozomal dominant hastaliklarda etkilenmis bir
  embriyonun transfer riski 11, resesif
  hastaliklarda ise 2dir.

36
PGDde PCR Uygulamalari

• Otozomal hastaliklarda tek gen defektlerinin
  belirlenmesi
• Erkek infertilitesinde tek gen defektlerinin
  belirlenmesinde
• Xe bagli hastaliklarda cinsiyet tayininde

37
FISH

• Özellikle, Xe bagli kalitilan hastaliklarda
  cinsiyet tayini, kromozomal düzensizlikler ve
  anöploidi taramalarinda kullanilmaktadir.
• Anöploidi taramalarinda sagladigi kolaylik
  nedeniyle PGSde daha yaygin kullanilir.
• Bu iselmde, incelenecek kromozomla eslesmek üzere
  prob (her prob farkli boya ile isaretli) adi
  verilen küçük DNA molekülleri kullanilmaktadir.
• Floresans mikroskobu ile yapilan inceleme sonucu
  her kromozom renklere göre ayirdedilir.
• Analiz edilebilecek kromozomlar 13,16,18, 21,
  (22),X ve Ydir.

38
FISH Yöntemi ?Denatürasyon . 730 C 5 dakika
?Hibridizasyon . 370 C 3 saat ?Hibridizasyon
sonrasi yikama . 2 dakika 0.4XSSC ?Analiz
39

• Hangi kromozomlar analiz ediliyor?
• X, Y, 13, 18, 21
• 13, 16, 18, 21, 22

40
18
16
18
21
13
22
13
21
16
22
NORMAL FISH
41
Trizomi 13 (Blastomer nükleusu)
42
CGH

• Embriyo nükleusu floresans bir boya ile
  isaretlenirken, bir kontrol hücresi farkli bir
  boya (genellikle yesil) ile isaretlenir.
• Iki hücrenin daha sonra kontrol metafaz plaginda
  kohibridizasyonu gerçeklesir.
• Iki renk yogunlugu arasindaki fark
  karsilastirilir.
• Kirmizi renk fazla ise embriyo nükleusu ekstra
  kromozom içermekte, yesil yogunlugu fazla ise
  embriyoda eksik kromozom bulunmaktadir.
• Bu teknik yaklasik 72 saati almaktadir.

43
PGD UYGULAMALARINDA DIKKAT EDILECEK HUSUSLAR

• Infertilite problemi olmayan hastalar IVF için
  yönlendirilir ve IVF tedavisi ile iliskili
  riskler hakkinda bilgilendirilir.
• Hastalara, PGD için yapilacak IVF islemi hakkinda
  genetik danisma mutlaka verilmelidir, ilgili
  kalitim paternleri ve hastaligin etkilenmis çocuk
  ve aile üzerindeki olasi etkileri detayli olarak
  anlatilmalidir.
• PGD veya PGS uygulamasi yapilacak olsa bile
  hastalara prenatal tani (amniyosentez, CVS,
  kordosentez) hakkinda mutlaka bilgi verilmelidir.
• Donör gametlerinin kullanilmasi gibi alternatif
  tedavi stratejileri de tartisilmalidir.
• Basarili bir IVF ve PGD gerçeklesse bile
  transferden sonra gebelik, zamaninda veya erken
  dogum garanti edilmez.

44

• Hücrenin zedelenmeden veya ciddi bir hasara
  ugramadan alinmasi islemi teknik olarak oldukça
  zordur, beceri ve deneyim gerektirmektedir.
  Embriyonun kazaya bagli olarak yaklasik 0.1
  oranainda hasar görme riski bulunmaktadir
• Yeni bir hastaliga yönelik tanisal metodoloji
  zaman alici ve pahali bir süreçtir.
• Tek bir hücrenin analiz ediliyor olmasi bazi
  sinirlamalari da beraberinde getirir. Eger
  embriyoda farkli hücre hatlari bir arada
  bulunuyorsa mozaisizm belirlenemez.
• Bu sebeple, özellikle amniyosentez gibi prenatal
  tani testleri ile sonuç dogrulanmalidir.
• Bazi durumlarda, çok sayida yumurta hücresi veya
  embriyo anormal olarak belirlenebilir. Bu sebeple
  az sayida embriyo transfer edilebilir veya
  embriyo transferi mümkün olmaz.

45

• Anöploidi taramalarinda, PGD ile tüm kromozomlar
  veya tüm anomaliler tanimlanamamaktadir. Çünkü
  bir test protokolünde, bir uygulamada sinirli
  sayida kromozom analiz edilebilir.
• Günümüzde, bir hücre biyopsisinde tek tip genetik
  arastirma uygulanabilmektedir. Çok sayida genetik
  arastirmanin ayni anda yapilmasi mümkün degildir.
• Kistik fibroz gibi çok sayida mutasyonun
  görüldügü tek gen hastaliklarinda PGD, ikna edici
  olmayabilir. Bu durumda çiftlere yeni problarin
  olusturulmasini gerektiren spesifik testler
  uygulanmalidir . Yeni problarin üretilme süreci
  birkaç haftayi almaktadir.

46
PGTde olasi yanlis tani nedenleri

• Çözüm
• Prenatal Tani

• PCR
• Allel dropout
• Kontaminasyon
• sperm/kumulus/DNA/hücreler
• Mozaiklik
• FISH
• Kontaminasyon
• Kumulus hücreleri
• Mozaiklik

47
PGS UYGULAMALARINDA DIKKAT EDILECEK HUSUSLAR

• PGS günümüzde hala tartisilan bir yöntemdir.
  Baslangiçta maternal yasa bagli risk artisinda
  embriyoda anöploidiyi önlemek için umut verici
  bir gelisme olarak kabul edilse de, son
  çalismalar belirli populasyonlarda basarinin
  sinirli oldugunu göstermistir.

48

• Tekniksel Sinirliliklar Günümüzde, FISH
  yöntemi ile 9-11 kromozom analizi mümkündür. CGH
  ve FISH ile yapilan çalismalarda, embriyodaki
  anöploidi 25 oraninda belirlenir ve normal
  olarak tanimlanir, anormal kromozomlar
  belirlenmez. Analiz edilen hücrelerin yaklasik
  10una sonuç verilemez veya tereddüt yasanir.

49

• Tek Hücre Analizinin Sinirliliklari
  Nondisjunction mayoz esnasinda olusmussa,
  embriyoya ait tüm hücrelerde anöploidi görülür.
  Ancak, mitoz esnasinda olusmussa, embriyoda iki
  veya daha fazla hücre hatti bulunabilir. Tek
  hücre biyopsisi, embriyodaki mozaisizmin
  belirlenmesinde yeterli degildir.

50

• Self-Correction Mozaik bir embriyonun,
  anormal hücrelerin proliferasyonunu durdurabilme
  özelligi sonucu, anöploidi tanimlanmis çogu
  embriyonun hayatta kalarak, yeniden analiz
  edildiginde normal olarak belirlendigini gösteren
  kanitlar mevcuttur.

51

• Ileri maternal yas nedeniyle uygulanan PGSden
  alinan sonuçlar degiskendir.
• Tekrarlayan gebelik kaybi görülen dengeli
  translokasyon tasiyicilari da PGSden
  yararlanabilmektedir.

52

• SART (Society of Assisted Reproductive
  Technology) and ASRM (American Society of
  Reproductive Medicine) mevcut yayinlarin, PGS ile
  ileri yas gebeligi, tekrarlayan gebelik kaybi ve
  implantasyon basarisizliginda canli dogum sansini
  yükseldigini desteklemedigini belirtmislerdir ve
  PGS sonuçlarina dayanarak tedavi seçeneginin
  belirlenmesini tavsiye etmemektedir.

53

• PGD veya PGS ile birlikte uygulanan IVF islemi
  neticesinde dogan bebeklerde fetal malformasyon
  ve diger problemlerde artis oldugunu gösteren bir
  yayina rastlanmamaktadir.
• Ancak yasamin ilerleyen dönemlerinde PGD veya PGS
  prosedürünün (biyopsi) bir sonucu olarak diger
  anomalilerin görülmesi olasiligi bulunmaktadir.

54

• PGD veya PGS ile birlikte uygulanan IVF islemi
  için basvuru orani, transfer edilen embriyo
  sayisinin azalmasi nedeniyle PGD ve PGS olmadan
  uygulanan IVF basvuru oranina göre daha düsüktür.

55
AVANTAJLAR

• Gebeligin geç dönemlerinde, abortus veya gebeligi
  sonlandirma gibi zor bir seçimle karsilasma
  durumunu ortadan kaldirir.
• Genetik bir hastaligin tasiyicisi oldugunu bilen
  ve çocuk sahibi olmayi düsünmeyen çiftler için
  yeni bir umuttur.
• Günümüze kadar, PGD veya PGS ile çok sayida bebek
  dünyaya gelmis ve fetal malformasyon veya diger
  tanimlanabilir problemlerde bir artis
  görülmemistir.

56
GELECEKTE

• Insanda ilk basarili PGD denemesi 1988de
  uygulanmistir, ancak yöntemin gelismesi ve kabul
  görmesi, tek hücre biyopsisinin gelistirilmesinin
  zaman almasi ve maliyeti nedeniyle yavas
  olmustur.
• PGD yeni bir uygulamadir ve hala yöntemin
  gelismesi için birçok çalisma devam etmektedir.
  Fakat PGDnin kapsamli, kabul gören ve yaygin
  uygulanan bir yöntem olmasi için çok daha fazla
  çalismaya ihtiyaç duyulmaktadir.
• PGD veya PGS uygulamalarinin sinirlandirilmasinin
  gerekliligi önemle vurgulanmaktadir.

57

• Gelecekte, diabet, hipertansiyon, kardiyovasküler
  hastaliklar, endometriyum kanseri gibi
  hastaliklarin genetik iliskisi daha iyi
  anlasilacaktir. PGD uygulamalariyla bu
  hastaliklarin kalitiminin önlenmesi mümkün
  olacaktir.
• PGSnin IVF için basvuran hastalara uygulanmasi
  hala tartisilan bir durum olsa da önemi,
  sagladigi fayda ve sonuçlari nedeniyle üreme
  teknolojisinde hala çekici bir yöntemdir.
• Bunun yani sira, belki de gelecekte PGS ile
  ilgili daha çok tartisma ve etik kaygi gündeme
  gelebilecektir

58
KAYNAKLAR

• Dayal MB, Zarek SM. Preimplantation genetic
  diagnosis. 2008
• Black, S.H. Preimplantation genetic diagnosis.
  Current Opinions in Pediatrics 1994 6, 712-716.
• Harper, J.C., Handyside A.H. The current status
  of preimplantation genetic diagnosis. Curr Obstet
  Gynecol 1994 4, 143-149.
• Schulman JH, Black SH. Preimplantation Genetic
  Testing for Huntington Disease and Certain Other
  Dominantly Inherited Disorders. Clinical Genetics
  1996

59
TESEKKÜRLER