Cultivos Celulares

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Cultivos Celulares

• Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular

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Objetivos
Puntos que deben ser asimilados

1. -Equipo básico de un laboratorio de cultivo
   celular
2. -Cultivos primarios y líneas estables
3. -Preparación del medio de cultivo
4. -Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad
5. -Rutina en el mantenimiento de la línea celular
   estable
6. -Congelación y almacenamiento de las líneas
   celulares

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Equipo Básico de un laboratorio de Cultivo Celular

1. Campana de flujo laminar
2. Baño termostatizado
3. Incubador CO2
4. Autoclave

5. Nevera y Congelador 6. Microscopio
Invertido 7. Micro centrifuga 8. Depósito de
Nitrógeno líquido
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Autoclave

• Cualquier recipiente, herramienta... Debe ser
  esterilizada

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Tanque de Nitrógeno líquido

• Congelación de líneas estables

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Campana de Flujo Laminar

• Esterilidad!! (no evita contaminación un mal uso)

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Incubador CO2

• Atmósfera controlada con elevada humedad y
  tensión de CO2

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Micro Centrifuga
Suspensiones celulares (lavados, concentrados,
subcultivos)
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Microscopio Invertido

• Seguimiento del cultivo viabilidad,
  multiplicación, contaminación.
• Control sobre cambios morfológicos (efectos de
  hormonas, de tratamientos con medicamentos, de
  iones, interacciones, etc.

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Botellas y Placas de Cultivo
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Puntos Importantes

• Esterilidad
• Asepsia
• Hábito de trabajo

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Cultivos Primarios(El principio de la
historia.....)

•      A- Aislamiento del tejido
•     B- Disección/disgregación
• C- Cultivo celular en recipiente
• (Placa Petri) (Cultivo primario)

Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo
primario a partir de cualquier tipo de tejido,
normalmente los tejidos embrionarios y tumorales
dan los mejores resultados, debido a que su grado
de diferenciación es menor y su capacidad de
división mayor.
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Preparación cultivos
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Cultivos secundarios y líneas estables

1. Si uno o varios tipos de células de un cultivo
   primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo
   obtenido se denomina cultivo secundario.
2. La heterogeneidad celular es menor el medio
   utilizado determinará qué células se
   desarrollarán.
3. Las líneas estables son las que se obtienen por
   sub-cultivo y selección de cultivos secundarios.
   También se pueden obtener a partir de tejidos
   tumorales.

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Selección de la línea estable
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Líneas celulares estables
Ventajas
Desventajas

• Control del entorno celular
• Homogeneidad celular
• Conocimiento del tipo celular
• Economía

• Falta de diferenciación
• Inestabilidad de la línea (mutaciones DNA)

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Medios de Cultivo Medios Base

• Medios base Eagles Basal Medium, Dulbeccos
  modified Eagles medium (DMEM), RPMI1640, etc.
• Contienen Hidratos de Carbono, ácidos grasos
  esenciales y otros lípidos, aminoácidos, sales
  minerales, oligoelementos.

Cada línea celular tiene unos requerimientos que
hacen que crezca mejor en un determinado tipo de
medio
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Medios de Cultivo Aditivos

• Antibióticos estreptomicina (Gram /-),
  penicilina (Gram ), amfotericina (levaduras y
  hongos)
• Buffer pH Hepes, bicarbonato, etc.
• Indicador pH.
• Suero fetal Bovino, ovino, humano. 10 (2-50).
• Aditivos específicos Suplemento de piruvato,
  suplemento de glucosa, etc.

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Tamponadores de pH

• Hepes
• Buffer tamponador que actúa de manera muy
  eficiente en el rango 7,2-7,6
• Importancia de la ppCO2 en el mantenimiento del
  pH
• H2O CO2 ?? H2CO3 ?? H HCO3-
• Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH)

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Propiedades físico-químicos del Medio
CO2 Normalmente 5 (2-8 depende de tipo celular
y HCO3- pH......................................
.......................(7.0-7.7) Osmolaridad......
.......................................(290-320)
mOsm/Kg Viscosidad................................
................ Suero Temperatura...............
.............................. 37ºC
(mamífero) (aves 38,5ºC epitelio de ratón
33ºC insectos 28ºC)
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Test de medio completo con suero

• Previamente a la realización de experimentos los
  medios deben ser probados a diferentes niveles.
• Posible Contaminación
• Niveles de Proliferación Celular (eficiencia)

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Elección del medio de cultivo adecuado a cada
línea celular

• Se deben realizar diferentes pruebas con varios
  medios de cultivo en la elección del medio más
  adecuado a las características de nuestra línea.
• Las pruebas consisten en la realización de
  diferentes curvas de crecimiento

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Conceptos básicos en el mantenimiento de una
línea estable

• Subcultivo
• Confluencia
• Tiempo de duplicación
• Criogenización
• Ciclo celular Fases G1,S,G2,M y G0

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Qué son y cómo se realizan los subcultivos?

• Objetivos
• Propagación de la línea celular
• Producción de células para la experimentación
• Usualmente se realizan al llegar a confluencia.
• Evitar que el medio de cultivo esté agotado.

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Curva de Crecimiento (líneas estables) Fases del
cultivo

• Fase de latencia (período lag). Fijación al
  sustrato e inicio del ciclo celular.
• Fase de crecimiento exponencial. El número de
  células se duplica aproximadamente cada 24 horas.
• Fase de confluencia. Las células del cultivo, que
  se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa
  inhibición por contacto suspensión consumo del
  medio).
• Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por
  demasiado tiempo, las células entran en una fase
  de senescencia que termina con la muerte de las
  células en cultivo.

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Curva de Crecimiento (líneas estables) Fases del
cultivo
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Subcultivos Celulares
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Protocolo Subcultivo

• Depende de las características de la línea
  celular con la que se esta trabajando.
• Células en suspensión
• Células adheridas al substrato

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Células Adheridas

• Para realizar el subcultivo de células
  adheridas se debe proceder al levantamiento de
  las mismas
• Tripsinización.
• Levantamiento Mecánico (raspado).

En células en suspensión es suficiente con
realizar una dilución en medio nuevo (o bien
adición de medio tras centrifugación).
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La Fase Experimental

• Objetivos
• Investigación de un fenómeno biológico
• Estudio de las bases moleculares de una patología
• Investigación de los mecanismos empleados por los
  fármacos
• Estudio de la toxicidad de determinados
  compuestos
• Investigación de la estructura y función de
  macromoléculas y orgánulos celulares

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La Fase Experimental

• Planteamiento
• Se cultivan en frascos separados las células
  control y las células problema. Se adiciona un
  compuesto o se cambian las condiciones
  experimentales del frasco problema y se mantiene
  la incubación durante un tiempo (minutos a días).
  Finalmente se determinan las diferencias entre
  las células tratadas (problema) y las no tratadas
  (control).
• En determinadas ocasiones no se realiza un
  tratamiento en paralelo de células en diferentes
  frascos, sino un tratamiento secuencial de las
  células control (antes y después de ciertas
  condiciones).

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La Fase Experimental

• Investigación
• Es la fase en la que utilizando una técnica
  experimental determinamos algún fenómeno celular.
  Podemos estudiar el efecto de una hormona sobre
  la localización de proteínas celulares mediante
  microscopia confocal (células vivas), podemos
  determinar mediante RT-PCR o western blot la
  expresión de un determinado gen o hacer un
  estudio completo de la expresión génica mediante
  proteómica y/o genómica (células muertas).

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La Fase Experimental

• Transfección Introducción de DNA externo con un
  vector de expresión.
• TIPOS Transitoria o estable.
• MÉTODOS
• Electroporación
• Fosfato cálcico
• Lipofección
• Microinyección