VIRUS

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VIRUS

• Microbiología II
• FMVZ
• Dra. Virginia Bolaños de Corzo

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Métodos de propagación

• Para fines diagnósticos la inoculación de
  animales es un medio para detectar virus en
  muestras clínicas, como el virus de la rabia en
  ratones lactantes.
• Actualmente el uso de animales experimentales
  como hospederos para propagación viral está
  limitado por razones éticas.

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• Huevos embrionados.
• Este sistema se usa para propagación viral con
  fines diagnósticos y de investigación.

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• Cuando se usa huevos embrionados, se debe
  considerar la posible presencia de anticuerpos
  maternos en el saco vitelino del huevo. Por lo
  que, frecuentemente es preferible obtener huevos
  embrionados de parvadas
• libres de patógenos específicos
• (spf)

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• Cultivo de explantes
• Estos son cultivos de pequeños fragmentos de
  tejidos específicos, tomados directamente del
  hospedero animal.

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• Los cultivos de explantes son útiles para el
  aislamiento viral.
• Se requieren para el aislamiento de algunos
  coronavirus. La demostración de latencia de
  algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede
  requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo
  (por ejemplo, trigémino).

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• Cultivos celulares primarios
• Estos se derivan de tejidos frescos que han
  sido digeridos enzimáticamente con tripsina u
  otras proteasas, para liberar células
  individuales. En condiciones in vitro las células
  de los cultivos primarios raramente pueden
  dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja.

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• A pesar del tiempo de vida limitado de los
  cultivos primarios, son ideales para el
  aislamiento de algunos virus. Los cultivos
  primarios raramente sobreviven más allá del
  vigésimo pase in vitro.

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• Cultivos semi-continuos
• Son por lo general de fibroblastos.
• Los cultivos semi-continuos tienden a morir
  entre el 30 y el 50 pase in vitro.
• Son útiles en la propagación de una gran
  variedad de virus.

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• Cultivos celulares continuos
• Estos cultivos se derivan de tejidos normales
  o neoplásicos y se caracterizan por su habilidad
  para ser propagados in vitro indefinidamente.
  Las líneas celulares continuas no son tan
  sensibles como las otras para propagación viral

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• Facilitan la propagación a gran escala de
  algunos virus para vacunas e investigación.
  Muchas líneas continuas están disponibles de
  proveedores como la Colección Americana de
  Cultivos Tipo (ATCC)

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• La mayoría de los laboratorios de virología
  almacenan en congelación alícuotas iniciales de
  sus cultivos continuos, debido a que las líneas
  celulares que están continuamente en cultivo
  pueden sufrir cambios en sus características
  celulares.
• Ej. Contaminación con otros virus.

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Concentración y purificación de virus

• Una vez que un virus ha sido propagado
  adecuadamente, necesita ser recuperado de las
  células hospederas y luego ser purificado. Esto
  se logra por varios procesos que involucran
  centrifugación diferencial (a diferentes
  velocidades), diálisis, precipitación,
  cromatografía y gradientes de densidad.

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Infectividad

• La infectividad es la habilidad de la partícula
  viral para infectar una célula hospedera. La
  temperatura en el exterior de la célula hospedera
  afecta fácilmente la capacidad del virus para
  conservar su infectividad

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Infectividad vrs temperatura

• A 60C disminuirá rápidamente, en segundos.
• A 37C disminuirá dramáticamente, en minutos.
• A 20C disminuirá, en cuestión de horas.
• La infectividad en las temperaturas antes
  mencionadas influyen en la transmisión del virus
  por contacto directo (a 37C) y por fomites (a
  20C).
• A 4C se pierde en cuestión de días.

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Almacenamiento

• Los tres métodos principales son
• Congelación a -70C, con o sin criopreservante.
• Congelamiento en nitrógeno líquido
• (-196C). Para almacenamiento por largos
  periodos
• Liofilización, en congelación o a temperatura
  ambiente.

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Visualización de los virus

• Los dos métodos principales usados para
  visualizar la estructura / morfología de los
  virus son la microscopía electrónica y la
  microscopía de fuerza atómica. Otros tipos de
  microscopía se usan para observar cambios
  inducidos por la replicación viral en las células
  infectadas

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Microscopia electronica

• La microscopía electrónica proporciona imágenes
  tridimensionales de viriones y de su localización
  (nuclear o citoplasmática) dentro de la célula
  hospedera en un momento dado durante la
  infección. La observación de viriones en células
  vivas no es posible, debido a que las muestras
  tienen que ser tratadas con metales pesados.

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Microscopia de fuerza atómica

• Los electrones son capaces de "atravesar por
  túnel" entre los átomos, provocando una fuerza
  pequeña pero cuantificable. El resultado de estas
  mediciones es un mapa detallado del contorno o la
  superficie de la estructura.La ventaja de la
  microscopía de fuerza atómica es que la
  preparación de la muestra es mínima y pueden
  usarse especímenes vivos.

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Microscopia óptica.

• Es útil para observar los efectos de la
  infección viral en la célula hospedera. El daño
  celular o la destrucción causada por el virus es
  conocida como efecto citopático (CPE por sus
  siglas en inglés). Los efectos citopáticos que
  pueden observarse incluyen

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• Células redondeadas y agregados en forma de
  racimo de uvas, como se observa con adenovirus.
• Células redondeadas, encogidas, lisadas, dejando
  gran cantidad de restos celulares, como se
  observa con los enterovirus.
• Células agrandadas y redondeadas en áreas
  focales, como los herpesvirus.
• Fusión de células que se convierten en células
  multinucleadas (sinsitios) como en el caso de
  paramyxovirus.

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• Además es posible observar cuerpos de inclusión,
  característicos de algunos virus

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Microscopia de fluorescencia

• Puede ser usada para visualizar células o
  tejidos infectados por virus, usando anticuerpos
  antígeno-específicos marcados con fluorocromos.
  El anticuerpo se une específicamente a los
  antígenos virales presentes dentro de las células
  o tejidos y los marca con la molécula
  fluorescente (generalmente fluoresceína)

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Enumeración indirecta de virus

• Los métodos indirectos de cuantificación viral
  son aquellos que usan factores asociados con la
  infectividad (actividad biológica). Los tres
  métodos principales usados para determinar
  indirectamente concentraciones virales son
• ensayos de hemoaglutinación,
• ensayos de formación de placas
• el método de la dilución limitante.

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Hemoaglutinacion

• Esta prueba se basa en la propiedad que tienen
  muchos virus envueltos para aglutinar glóbulos
  rojos.Se realiza en una microplaca, añadiendo
  glóbulos rojos a diluciones de la muestra que
  contiene virus, y observando posteriormente la
  hemoaglutinación.

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• La hemoaglutinación es útil en la concentración y
  purificación de algunos virus, y como prueba
  presuntiva rápida para la presencia de este tipo
  de virus en fluidos de cultivos celulares
  infectados y de embriones de pollo.

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Formacion de placas

• la inoculación de células hospederas susceptibles
  con un virus, y usar su actividad biológica para
  estimar el número de viriones presentes.En este
  procedimiento se usan diluciones decimales
  seriadas del virus para inocular monocapas de
  células hospederas

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• Con los virus citopaticos la destrucción de las
  células lleva a la formación de zonas desocupadas
  llamadas placas, que pueden ser vistas entre las
  24 y 72 horas de incubación.

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El método de dilución limitante

• Basado en titulación, mide un efecto in vitro
  sobre las células, como el CPE, cuando éstas se
  expone a varias diluciones de la solución que
  contiene el virus. Dependiendo del virus, se
  hacen diluciones seriadas dobles o diluciones
  seriadas decimales del material viral y se ponen
  en contacto con las células.

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• . El título infectivo (el recíproco de la
  dilución más alta que provoca el 50 de CPE en el
  cultivo infectado) se expresa como TCID50/ml
  (dosis infectiva 50 cultivo celular). Este ensayo
  puede usarse con células en cultivo, embriones de
  pollo o incluso con animales de laboratorio.

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Metodos Inmunologicos

• Los animales infectados con virus responden
  produciendo anticuerpos específicos. La detección
  y cuantificación de estos anticuerpos, reflejan
  el estado de la enfermedad.