Metody detekce nukleotidov

1
Metody detekce nukleotidových polymorfismu

• MUDr. Michal Jurajda
• ÚPF LF MU

2
Typ polymorfismu

• SNP
• Short repeats
• Insertion/deletion

3
Metody detekce nukleotidových polymorfismu

• Hledání prítomnosti neznámé alely
• Detekce známých alel

4
Využívané metodiky

• PCR
• RFLP
• ELFO na agaróze
• Real time PCR
• PAGE
• SSCP, heteroduplexní analýza
• Kapilární elektroforéza
• v podstate varianta PAGE

5
Strategie volby metody

• Flexibilita
• Cena
• Dostupnost
• rychlost

6
PCR

• 1983 Kary Mullis
• 1993 Nobelova cena

7
Amplifikace DNA
8
Základní komponenty reakce

• voda
• pufr
• dNTP (dATPdTTPdCTPdGTP)
• MgCl2
• Taq polymeráza
• primers
• templát

9
Teplotní režim

• 96ºC Iniciální denaturace
• 96ºC denaturace
• 40-72ºC annealing
• 72ºC elongace
• 72ºC záverecná elongace
• 4ºC zchlazení

30x
10
Elektroforéza v agarovém gelu
11

-
12
Prímá sekvenace

• Viz praktikum ?
• Umožní detekovat dosud nepoznané
  mutace/polymorfismy
• Drahá
• Relativne zdlouhavá
• Metody využívající sekvenacní instrumentárium

13
PCR s následnou RFLP

• Pokud polymorfismus zpusobuje vznik restrikcního
  místa, podrobíme produkt PCR pusobení daného
  enzymu a na agarové elektroforéze pozorujeme
  výsledek.
• Mismatch primery umožnují vnést restrikcní
  místo do blízkosti SNP a umožní jeho detekci
  pomocí endonukleáz

14
PCR s následnou analýzou délky produktu

• Pokud je polymorfismus zpusoben insercí/delecí
  vetšího poctu bází, produkt PCR analyzujeme prímo
  na agarové elektroforéze. V prípade analýzy poctu
  dinukleotidových repetic používáme kapilární
  elektroforézu.
• Alelove specifické primery poskytnou produkt
  jen za prítomnosti dané aley

15
Real-time PCR

• Ruzné systémy sond (TaqMan, FRET)
• Melting curve analysis

16
Metody využívající kapilární sekvenátor

• SNPlex
• SNaPshot