CONTR

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CONTRÔLE DE LA PASTEURISATION DU LAIT
BTS DIETETIQUE 1
TP DE BIOCHIMIE

• Recherche de lactivité phosphatase alcaline

2
Conservation du lait
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3
But

• Vérifier la pasteurisation dun lait
• Par la recherche de lactivité phosphatase
  alcaline
• Méthode de Aschaffensurg et Muellen

4
Principe

• Mise en évidence de lactivité enzymatique par
  une réaction colorée

H2O
4-nitrophénylphosphate Paranitrophénylphosphate (P
NPP)
4-nitrophénol Paranitrophénol (PNP)
Absorbe la lumière à 415 nm Suit A ?? . C . l
INCOLORE
5
Mode opératoire Gamme étalon

• Gamme étalon de PNP
• Permet de mettre en relation A et CPNP

N tube 1 2 3 4 5 6
PNP (0,1 mmol.L-1) (mL) 0 0,5 1 2 3 4
NaOH (0,2 mol.L-1) (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Eau déminéralisée (mL) 4,5 4 3,5 2,5 1,5 0,5

• Permet de tracer la droite détalonnage (Excel)

Y aX b R2
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Mode opératoire Lait à tester

• Traitement des échantillons
• 2 témoins
• T Lait cru (PAL active)
• T? Lait UHT (PAL inactif)
• 1 échantillon à tester (X)
• Tous les échantillons sont traités de la même
  manière et en même temps

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Mode opératoire Lait à tester
N tube à hémolyse N tube à hémolyse Blanc X T T
Solution de PNPP (5 mmol.L-1) (mL) Solution de PNPP (5 mmol.L-1) (mL) 5 5 5 5
Eau déminéralisée (mL) Eau déminéralisée (mL) 2 2 2 2
Boucher et porter 5 minutes au bain-marie à 37C puis ajouter  Boucher et porter 5 minutes au bain-marie à 37C puis ajouter  Boucher et porter 5 minutes au bain-marie à 37C puis ajouter  Boucher et porter 5 minutes au bain-marie à 37C puis ajouter  Boucher et porter 5 minutes au bain-marie à 37C puis ajouter  Boucher et porter 5 minutes au bain-marie à 37C puis ajouter 
Acide trichloracétique (TCA) (µL) Acide trichloracétique (TCA) (µL) 1 0 0 0
Lait à analyser DILUES au 100ème (µL) X 0 1 0 0
Lait à analyser DILUES au 100ème (µL) T 0 0 1 0
Lait à analyser DILUES au 100ème (µL) T 0 0 0 1
Eau déminéralisée (µL) Eau déminéralisée (µL) 2 1 1 1
Boucher, mélanger et laisser incuber exactement 30 minutes à 37C, puis ajouter  Boucher, mélanger et laisser incuber exactement 30 minutes à 37C, puis ajouter  Boucher, mélanger et laisser incuber exactement 30 minutes à 37C, puis ajouter  Boucher, mélanger et laisser incuber exactement 30 minutes à 37C, puis ajouter  Boucher, mélanger et laisser incuber exactement 30 minutes à 37C, puis ajouter  Boucher, mélanger et laisser incuber exactement 30 minutes à 37C, puis ajouter 
Acide trichloracétique (TCA) (µL) Acide trichloracétique (TCA) (µL) 0 1 1 1
Boucher, mélanger et laisser reposer 10 minutes puis filtrer les tubes A, B et S. Boucher, mélanger et laisser reposer 10 minutes puis filtrer les tubes A, B et S. Boucher, mélanger et laisser reposer 10 minutes puis filtrer les tubes A, B et S. Boucher, mélanger et laisser reposer 10 minutes puis filtrer les tubes A, B et S. Boucher, mélanger et laisser reposer 10 minutes puis filtrer les tubes A, B et S. Boucher, mélanger et laisser reposer 10 minutes puis filtrer les tubes A, B et S.
Filtrats obtenus Filtrats obtenus FB FX FT- FT
SUBSTRAT
ECHANTILLON CONTENANT LENZYME
ARRET DE LA REACTION ENZYMATIQUE (précipitation)
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Mode opératoire Dosage
Tube à hémolyse FB FX FT? FT
Filtrat correspondant (mL) 1,5 1,5 1,5 1,5
NaOH (0,2 mol.L-1) (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5
Eau déminéralisée (mL) 3 3 3 3

• Lecture à 415 nm après 15 min de repos
• Lecture de tubes FX, FT? et FT contre de blanc FB

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Résultats

• Courbe détalonnage donne la concentration de PNP
  pour chaque filtrat
• Calcul des dilutions
• Dilution créée lors du traitement de
  léchantillon
• VLAIT
• VTOTAL
• Dilution originale du lait (1/100)

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Résultats

• Détermination de lAE Phosphatase alcaline

• Unité de lAE
• UI µmol de P formé par min
• Katal mol de P formé par seconde

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CONTRÔLE DE LA STERILISATION DU LAIT
BTS DIETETIQUE 1
TP DE BIOCHIMIE

• Recherche de lactivité lactoperoxydase

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Conservation du lait
Inactive
Inactive
Inactive
Active
Active
Inactive
Inactive
Active
13
But

• Vérifier la stérilisation dun lait
• Par la vérification de lactivité lactoperoxydase
• Technique de Dupouy

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Principe

• Mise en évidence de lactivité enzymatique par
  une réaction colorée

Gaiacol oxydé
2 H2O
H2O2
Gaiacol réduit
INCOLORE
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Mode opératoire
N tube à hémolyse N tube à hémolyse X T T
Lait à analyser NON DILUES (mL) X ?1
Lait à analyser NON DILUES (mL) T ?1
Lait à analyser NON DILUES (mL) T ?1
Solution de gaïacol 1,9 (mL) Solution de gaïacol 1,9 (mL) ?1 ?1 ?1
H2O2 5 vol. (450 mmol.L-1) H2O2 5 vol. (450 mmol.L-1) 1 goutte 1 goutte 1 goutte
Boucher, agiter et laisser reposer 1 minute à température ambiante Boucher, agiter et laisser reposer 1 minute à température ambiante Boucher, agiter et laisser reposer 1 minute à température ambiante Boucher, agiter et laisser reposer 1 minute à température ambiante Boucher, agiter et laisser reposer 1 minute à température ambiante
Observer la coloration. Observer la coloration. Observer la coloration. Observer la coloration. Observer la coloration.
RESULTATS
Lait X T T
Couleur après 1 minute dincubation