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L'interfase è il periodo tra successive mitosi e
consiste in tre fasi G1, S, e G2. Durante la
fase S (sintesi), le molecole di DNA di ogni
cromosoma vengono replicate producendo un
identico paio di molecole di DNA chiamate
cromatidi (talvolta cromatidi "fratelli"). Ogni
cromosoma replicato quindi entro in mitosi con
due molecole identiche di DNA. Sottili filamenti
di cromatina appaiono comunemente come materiale
granulare amorfo nel nucleo colorato di cellule
in interfase.
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Prima e dopo la fase S vi sono due periodi di
intensa attività metabolica, crescita e
differenziamento, detti G1 (gap intervallo 1)
G2 (gap 2). Durante la fase G1 le cellule si
preparano per la sintesi di DNA (fase S) e
durante la G2 hanno luogo la crescita e
l'espansione cellulare. Le cellule possono uscire
dal ciclo cellulare in fase G1 ed entrare in uno
stato di riposo, o G0. Le cellule in G0 non
proliferano ma sono vitali e metabolicamente
attive, e possono rientrare nel ciclo attraverso
la fase G1. Una volta in G1 la cellula è
obbligata a completare il ciclo.
3
La fase M, o mitosi, comprende quattro tappe
principali considerate in dettaglio più avanti
profase, metafase, anafase e telofase. La mitosi
è di solito la fase più breve del ciclo
cellulare, occupando 1 h del tempo totale di
18-24 h richiesto per il ciclo completo in una
cellula animale ideale. Il tempo trascorso in
ogni fase della mitosi varia notevolmente. La
profase richiede molto più tempo delle altre la
metafase è la più breve.
4
(No Transcript)
5
Cyclin/cdk complexes are required at specific
cell cycle transitions
6
G1 cyclins segnalano alla cellula di preparare i
cromosomi per la replicazione S-phase promoting
factor (SPF) preparano la cellula a entrare in
fase S e duplicare il DNA durante la sintesi di
DNA la ciclina E si degrada e compaiono le
cicline di fase M (mitotiche) M-phase promoting
factor (MPF) inizia - Lassemblaggio del fuso
mitotico - Dissolvimento dellinvolucro
nucleare - Condensazionedei cromosomi Inizia la
metafase A questo punto MPF attiva il copmesso
APC (Anaphase Promoting Complex)che permette
E
A
B
1) la separazione dei cromatidi fratelli e la
migrazione ai poli 2) la degradazione delle
cicline mitotiche (M-phase) 3) avvia la sintesi
delle cicline della fase G1per il ciclo
successivo 4) degradazione della geminina, una
proteina che blocca la replicazione pre-mitotica
del DNA sintetizzato in fase S. ,
7
(No Transcript)
8
(No Transcript)
9
Control of Cell Cycle

• The cell cycle has checkpoints where feedback
  information from the cell can trigger the next
  phase
• Proteins are responsible for the control through
  bonding to signal receptors.
• 3 checkpoints G1 checkpoint- makes the decision
  as to whether the cell will divide. If conditions
  are favorable. Like the cell is healthy and large
  enough proteins will stimulate the cell to start
  the S Phase. The cell cycle can also be stopped
  or sent to a resting point, Ex. Muscle and nerve
  cells, at this checkpoint.

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• G2 checkpoint- DNA replication is checked hear by
  DNA repair enzymes. If the DNA is copied
  correctly with no errors proteins then signal
  mitosis phase.
• Mitosis Checkpoint- Triggers the exit from
  mitosis phase.

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G1 Checkpoint
Cell Cycle Arrest DNA Repair
12
G1 Checkpoint
Apoptosis
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(No Transcript)
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Danno prima dellentrata in S
G1/S checkpoint
Mediato dalle chinasi Chk1 e Chk2
Arresto rapido della replicazione, dovuto alla
degradazione della fosfatasi Cdc25A la cui
normale funzione e di defosforilare e così
attivare la chinasi Cdk2 del complesso SMP, che
a sua volta attiva la proteina Cdc45, che è
essenaziale per lassemblaggio del complesso di
replicazione sullorigine di replicazione del DNA
Mantenimento prolungato
Rapido e transiente
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Il gene p53

• Poco più del 50 dei tumori umani presenta
  mutazioni di questo gene. Nella maggior parte dei
  casi, le mutazioni inattivanti che colpiscono
  entrambi gli alleli p53 sono acquisite dalla
  cellula somatica. Meno frequentemente alcuni
  soggetti ereditano un allele p53 mutato (sindrome
  Li-Fraumeni) e possono sviluppare numerosi tipi
  di neoplasie quali
• Sarcomi
• Carcinomi della mammella
• Leucemie
• Tumori cerebrali
• Carcinomi della corticale del surrene.
• Rispetto alle forme sporadiche, le forme
  ereditarie si presentano in soggetti più
• giovani.
• La proteina p53 è localizzata nel nucleo ed entra
  in gioco come freno
• demergenza quando il DNA è danneggiato da
  radiazioni ionizzanti, raggi UV o
• sostanze chimiche.

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Attivazione di p53 in risposta al danno del DNA
IR,UV, MMC.etposide,ROS

p53, inattivo e stabile Geni target on
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p53 si lega al DNA e stimola la trascrizione di
alcuni geni che mediano due funzioni
fondamentali larresto del ciclo cellulare e
lapoptosi.
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(No Transcript)
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Sono stati identificati studiando malattie rare
come il retinoblastoma, che colpisce 1 bambino su
20.000.
40 casi familiari con trasmissione autosomica
dominante, tumori multipli si sviluppano nella
retina di entrambi gli occhi nella prima
settimana dalla nascita.
60 casi sporadici, un singolo tumore si
sviluppa in un occhio nella prima infanzia.
Affinché il retinoblastoma si sviluppi è
necessario che entrambi gli alleli siano inattivi.
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Prodotti proteici degli oncosoppressori.

1. Molecole che regolano la trascrizione nucleare ed
   il ciclo cellulare.

Il gene Rb
Rb è stato il primo gene oncosoppressore
scoperto. Il suo prodotto è una fosfoproteina
nucleare, pRb, che nel suo stato attivo
(IPOfosforilato) costituisce un freno al
passaggio dalla fase G1 alla fase S del ciclo
cellulare.
21
La forma attiva di pRb complessata ai fattori di
trascrizione E2F si lega al DNA ed inibisce la
trascrizione dei geni i cui prodotti sono
necessari alla fase S del ciclo cellulare.
Quando i complessi ciclina D/CDK4,6 e ciclina
E/CDK2 la inattivano IPERfosforilandola, rilascia
i fattori E2F.
I fattori E2F formano eterodimeri con la famiglia
di proteine DP ed attivano la trascrizione di
diversi geni bersaglio
Quindi, se la proteina pRb è assente o alterata
da mutazioni, la cellula progredisce verso la
fase S senza alcun freno.
22
(No Transcript)
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REGOLAZIONE DEL CICLO CELLULARE DA PARTE DEI
NUTRIENTI
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Vitamina A
25
(No Transcript)
26
AF1
LBD - AF2
DBD
Helix 12
A/B
C
D
E/F
Nuclear Hormone Receptor
Superfamily
Type II family
Type I family
Steroid family
Non-steroid family
GR
TR a, b
RAR a, b, g
PR
AR
RXR a, b, g
VDR
MR
PPAR a, g, d
ER a, b
CAR, SXR/PXR
LXR a, b, FXR
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Conserved domains of transcription factors in
nuclear-hormone receptor superfamily
A/B
C
E
AF-2 domain
Two non-repeating C4 Zn finger motif
AF-1 domain
Fig 11.41 Lodish et al. Molecular Cell Biology
28
Retinoid X Receptor (RXR)
E espresso in tutte le cellule Regola numerosi
processi eterodimerizzando con altri
recettori nucleari (PPAR, VDR, LXR, FXR.) Il
suo ligando naturale e lacido 9 cis retinoico,
..altri ?
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Diverse Structure of Ligands for Nuclear
Receptors
30
Ligand Induces a Conformational Change in the
LBD that Repositions helix 12
No Ligand
Agonist
31
NR Antagonists Alter the Position of Helix 12
Agonist (ER)
Antagonist (ER)
No Ligand
32
(No Transcript)
33
Consensus sequences of DNA response elements for
different nuclear hormone receptors
The glucocorticoid receptor and
oestrogen receptor bind to their respective
response elements as homodimers. The response
element is an inverted repeat
The vitamin D receptor, the thyroid hormone
receptor and the retinoic acid receptor bind to
their respective response elements as
heterodimers (with RXR). The response element
is an direct repeat. The spacing between these
repeats determines the specificity of the
interaction.
Fig 11.42 Lodish et al. Molecular Cell Biology
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RAR
A B C D
E F
A/B dominio di transattivazione INDIPENDENTE dal
ligando C dominio che lega il DNA D cerniera E dom
inio che lega il ligando e dimerizzazione F funzio
ne non conosciuta
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RARE
RAR-RXR AGGTCAnnnnnAGGTCA (DR5) RXR-RXR AGG
TCAnAGGTCA (DR1)
RXRE
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(No Transcript)
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Nuclear Hormone Receptor- Ligand Complex Action 2
Recruitment of Coactivators is Necessary They are
an Obligate Bridge to Pol II complex
Receptor-ligand can bind DNA and NOT recruit
pol II Antagonist
38
(No Transcript)
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In tumori sensibili lacido retinoico causa un
arresto della crescita cellulare cellule
normali tumori sensibili t. resistenti T
rattamento con - a.retinoico Trasfezione
Con crescita crescita crescita RARb
inibita inibita inibita
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• RARb ha 2 sottotipi RARb2 e RARb4
• RARb2 funziona come un gene soppressore di tumore
• RARb4 come un dominante negativo
• Topi transgenici con poco RARb2 o con molto RARb4
• sviluppano tumori.
• Quindi lacido retinoico agisce come soppressore
  della crescita
• cellulare legandosi a RARb2, mentre elevati
  livelli di RARb4
• sopprimono questo effetto (tumori resistenti
  allacido retinoico)

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RETINOIDI e NEUROBLASTOMA
Retinoidi inducono differenziamento in cellule
nervose Nei neuroblastomi inducono
apoptosi DNA Microarray hanno dimostrato
linduzione di geni Pro-apoptotici da parte di
retinoidi
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Confronto dei profili di espressione genica in
due campioni cellulari diversi
Estrazione dellmRNA dai 2 campioni di cellule
che si vogliono confrontare
(1)
(2)
Conversione in cDNA
(6)
Immagine a colori raffigurante il microarray
Marcatura con 2 fluorocromi diversi
(3)
Eccitazione della fluorescenza tramite laser
(4)
(5)
Riconoscimento tra i cDNA
provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti
sul microarray
43
(No Transcript)
44
LAcido retinoico induce arresto della crescita
cellulare oppure proliferazione a seconda del
tipo cellulare (es. epidermide o epitelio
tracheale). Topi privati di vitamina A
sviluppano molti tumori specialmente da epitelio
tracheale. Trattamento con acido retinoico le
blocca in G1 Ac. Retinoico -
ciclinaD1
mRNA
45
Acido retinoico
Induzione dei geni Addetti alla Ubiquitinazione
Ciclina D1
Ciclina D1
Degradazione e arresto in G1
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EFFETTO ANTIPROLIFERATIVO DELLACIDO RETINOICO
SU VARI TUMORI
Tumore ciclina repressa Trachea D1 Neuroblastom
a D3 Mieloide (U937) A, B, D2, D3, E Epatoma D1
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Vitamina D
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Produzione della Vitamina D da UVB

• UVB (290-315 nm) converte 7-deidrocolesterolo in
  pre-vitamina D
• Previtamina D3 subisce una isomerizzazione che
  risulta nella formazione della vitamina D3 (25
  idrossivitamina D (25(OH)D))
• Questa e convertita in 1,25-diidrossivitamina D3
  (1,25(OH)2D3) nel fegato e nei reni

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(No Transcript)
50
AF1
LBD - AF2
DBD
Helix 12
A/B
C
D
E/F
Nuclear Hormone Receptor
Superfamily
Type II family
Type I family
Steroid family
Non-steroid family
GR
TR a, b
RAR a, b, g
PR
AR
RXR a, b, g
VDR
MR
PPAR a, g, d
ER a, b
CAR, SXR/PXR
LXR a, b, FXR
51
Diverse Structure of Ligands for Nuclear
Receptors
52
(No Transcript)
53
Consensus sequences of DNA response elements for
different nuclear hormone receptors
The glucocorticoid receptor and
oestrogen receptor bind to their respective
response elements as homodimers. The response
element is an inverted repeat
The vitamin D receptor, the thyroid hormone
receptor and the retinoic acid receptor bind to
their respective response elements as
heterodimers (with RXR). The response element
is an direct repeat. The spacing between these
repeats determines the specificity of the
interaction.
Fig 11.42 Lodish et al. Molecular Cell Biology
54
(No Transcript)
55
La vitamina D causa un arresto della
proliferazione cellulare e differenziamento
in cheratinociti osteoblasti cellule
ematopoietiche VDR e specialmente espresso
nelle sopracitate cellule quando sono proliferanti
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Crescita dopo trattamento con Vitamina D Cellule
di tumore prostatico Alva-31(linea
cellulare) 50 0 Arresto in G1
57
La mortalita del tumore alla prostata aumenta
con la diminuzione alla esposizione alla luce
solare I livelli di vitamina D circolanti
diminuiscono con leta Alti livelli di sintesi
di melanina correlano con un aumento
dellincidenza di tumori alla prostata
Crescita dopo trattamento con Vitamina
D Alva-31(linea cellulare) Alva-31(linea
cellulare) VDR
antisenso 0 100
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La forma attiva di pRb complessata ai fattori di
trascrizione E2F si lega al DNA ed inibisce la
trascrizione dei geni i cui prodotti sono
necessari alla fase S del ciclo cellulare.
Quando i complessi ciclina D/CDK4,6 e ciclina
E/CDK2 la inattivano IPERfosforilandola, rilascia
i fattori E2F.
I fattori E2F formano eterodimeri con la famiglia
di proteine DP ed attivano la trascrizione di
diversi geni bersaglio
Quindi, se la proteina pRb è assente o alterata
da mutazioni, la cellula progredisce verso la
fase S senza alcun freno.
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X
Vitamina D
Induzione di p21 Rilascio di citocromo
C Repressione di geni Antiapoptotici
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(No Transcript)
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(No Transcript)
62
Promotore di p27
Gene Luciferasi
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(No Transcript)
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(No Transcript)
65
(No Transcript)
66
Vitamina D
p27 p27fosforilata
(proteina piu stabile meno stabile)
Arresto in G1
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Paracalcitolo (analogo della vitamina D)
HL60 (linea leucemica) A concentrazione
nanomolare riduce le cellule in fase S Aumenta le
cellule in fase G1 Ha effetto pro-differenziante A
umenta il numero di cellule che vanno incontro ad
apoptosi
68
(No Transcript)
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Trattamento con Vit D3 aumenta lespressione
della Tuberina
(gene Oncosoppressore)
or Vit D3
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(No Transcript)
71
(No Transcript)
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Attivita del promotore di p21
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TGF-b e Vit D3 aumentano lespressione della
Tuberina, di p21 e diminuiscono la ciclina A
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Cellule ERa Il trattamento con vitamina D
induce i geni per Molecole di
adesione p53 p21 Retinoblastoma Varie caspasi
TGFb e il gene per il retinoblastoma sono indotti
in tutti e due i tipi cellulari
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Lo svantaggio maggiore per un suo impiego come
farmaco antitumorale e la sua enorme influenza
sul metabolismo del calcio e dellosso.