Presentaci

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Separación de células y fraccionamiento subcelular
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Métodos físicos de SEPARACION DE CELULAS
Necesarios para estudiar - Tejidos con
diferentes tipos celulares - Células con
diferente funcionalidad/ actividad biológica -
Subpoblaciones celulares con diferentes
marcadores moleculares - Alternativa a la
clonación rápidos, rendimiento, (-
pureza) Los más empleados explotan diferencias
en Tamaño celular Densidad Carga/Química
superficial Dispersión de la luz (light
scatter) Emisión de Fluorescencia
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b
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Beckman J2-21M, centrífuga equipada con un rotor
y sistema de elutriación
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Rotor de elutriación (Beckman)
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Cámara de separación del rotor de elutriación
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(No Transcript)
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Separacion de células por elutriación
Apariencia de las células aisladas de una
fraccion de elutriación de células sanguíneas de
la médula ósea humana cultivadas durante 8 días
(a, b). Las células predominantes son de tipo
fibroblastoide con un núcleo central, citoplasma
difuso y pseudopodos aderentes y células grandes,
redondas con un estrecho citoplasma y un núcleo
central redondo. (tinción con hematoxilina). (a)
x200 (b) x400. (c) Apariencia de las células
aisladas de la misma fracción de elutriación y
cultivadas en DMEM20 FCS suplementado con
dexametasona, ácido ascorbico y b-glicerofosfato
durante 8 días. En esas condiciones, las celulas
presentan una morfologia redondeada o cuboidal
con un núcleo central, x200.
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Separación de células sanguíneas con
Ficoll-Hypaque
Centrifugación
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(No Transcript)
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Separación inmunomagnética
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Selección negativa
Selección positiva
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(No Transcript)
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Absorción de luz por un e- y la
subsiguiente emisión de E como calor y
fluorescencia
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Esquema de un Citómetro de Flujo (FACS)
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Funcionamiento de la boquilla vibradora de un
citómetro de flujo
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Representación de los datos en citometría de flujo
Green fluorescence
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(No Transcript)
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Esquema de un Citómetro de Flujo clasificador
(sorter)
Puede seleccionar 1/1000 células y clasificar
miles/s
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Microdisección con láser
Biopsy at the Single Cell Level
Sperm Tail Removal
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Fraccionamiento de componentes subcelulares

• Diseñados inicialmente para comprender el papel
  bioquímico de cada orgánulo en la célula
• La lisis (rotura) celular se suele realizar por
• Potter, homogeneizador mecánico de tejidos,
  sonicación, cavitación, soluciones hipotónicas
• La separación de los componentes subcelulares
  se realiza generalmente por centrifugación

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(No Transcript)
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Homogeneización de la muestra
Centrífuga de alta velocidad
Potter
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Fraccionamiento subcelular por centrifugación
diferencial
80.000 x g, 1 h (ultracentrífuga)
1000 x g, 10 min
150.000 x g, 3 h
20.000 x g, 20 min
citosol
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Comparación de la sedimentación por velocidad
(A) y por equilibrio de sedimentación (isopícnica,
B)
5-20
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Purificación de orgánulos por centrifugación en
gradiente de densidad
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(No Transcript)
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Control de calidad del fraccionamiento TEM
Núcleos
Microsomas (RER)
Peroxisomas