Apresenta

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Cinética Enzimática
Prof. Dr. Henning Ulrich
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Influência do Substrato

• Concentração de substrato S afeta a
  velocidade da reação
• Efeito de S varia durante o curso de uma
  reação ?S ? P
• Velocidade inicial (V0) S gtgt E ? tempo
  muito curto ? S constante.

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Influência do Substrato

• E cte
• ? S V0 ? linear
• ? S V0 ?
• V0 Vmáx

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Influência do Substrato

• Alguns casos a V0 não pode ser medida
• Não existe técnica experimental
• Equação química não representa a transformação
• Velocidade da reação
• Velocidade média de consumo ou produção
• Variação de uma propriedade no sistema.

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Influência do Substrato

• Vitor Henri (1903) E liga-se ao S para formar
  ES ? passo obrigatório
• Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)
• E combina-se reversivelmente com S ?ES
• k1
• E S ES
• k-1
• ES se rompe ? E e P
• 
  k2
• ES E P
• 
  

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Influência do Substrato

• Qualquer instante da reação E e ES
• S ? velocidade da reação ? S
• Vmáx todas as moléculas de E estiverem na
  forma ES ? enzima saturada
• ? S estado pré-estacionário ? ? ES
• Estado estacionário ? ES cte
• V0 ? estado estacionário.

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Equação Michaelis-Menten

• Curva possui a mesma forma para a maioria das
  enzimas
• Expressa pela Equação de Michaelis e Menten

• Hipótese limitante ? quebra de ES ? E P.

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Equação Michaelis-Menten

• Equação da velocidade para uma reação catalisada
  enzimaticamente e com um único substrato
• Relação quantitativa entre a V0, a Vmáx e a S
  inicial relacionadas através de Km.

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Equação Michaelis-Menten

• Relação numérica V0 é metade de Vmáx
• km afinidade pelo substrato
• ? Km ? afinidade

• Vmáx é proporcional à E.

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Significado de Km e Vmáx

• Equação Michaelis e Menten dependência
  hiperbólica
• Mecanismos de reação diferentes ? catalisam
  reações com 6 ou 8 passos
• Significado e magnitude de Vmáx e Km varia
• Km depende de aspectos específicos do mecanismo
  de reação.

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Significado de Km e Vmáx

• K2 ltlt K-1 ? afinidade da enzima
• K2 gtgt K-1
• K2 e K-1 são comparáveis a Km ? função complexa
• Vmáx número de passos da reação e identidade
  dos passos limitantes.

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Significado de Km e Vmáx
K1 K2
K3
E S ES EP E P
K-1 K-2

• Enzima na saturação EP e Vmáx k3.Et
• Kcat velocidade limitante de qualquer reação ?
  enzimas saturadas
• Kcat e Km ambiente celular, concentração do
  substrato e química da reação.

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Complexo enzima-substrato ES v (formação) k1
S E v (degradação) k-1ES k2 ES
(k-1 k2) ES Estado estacionário (steady
state) ES constante v de formação v de
degradação ou k1 S E (k-1 k2) ES
S E / ES (k-1 k2) / k1 (k-1 k2) /
k1 Km
Constante de Michaelis ES S E / Km E
ET ES ES (ET ES) S /
Km ES ET S / Km ES S / Km ES
ES S / Km ET S / Km (ES Km ES
S) / Km ET S / Km ES (Km S) /
Km ET S / Km ES ET S / Km S
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ES ET ( S / Km S ) ES
v / k2 ET Vmax / k2
v / k2 Vmax / k2 ( S / Km S )
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(No Transcript)
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Parâmetros Cinéticos

• Exemplo
• S (g/L) Vo (g/L.h)
• 0,25 0,78
• 0,51 1,25
• 1,03 1,66
• 2,52 2,19
• 4,33 2,35
• 7,25 2,57

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Parâmetros Cinéticos

• Exemplo Lineweaver-Burk

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Inibidores Competitivos

• Forma estrutural substrato ? competição
• Porcentual de inibição ? concentrações e
  afinidade pela enzima.

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Inibidores Competitivos

• ? S ? Vmáx
• Km ?
• Experimento
• 1º ? E, S cte
• 2º ? E, I cte

1/V0 x 1/S
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Inibidores Competitivos

• Equação de Michaelis e Menten
• Lineweaver-Burk

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Inibidores Competitivos

• Relação entre as velocidades com e sem inibidor

• S ? influência do I desprezível.

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Inibidores Não-Competitivos

• Ocupa outro sítio ? ES, EI e EIS
• S ? não leva todas as E ? produtiva
• Vmáx ? e Km normal.

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Inibidores Não-Competitivos

• Equação da velocidade
• Lineweaver-Burk

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Inibidores Incompetitivos

• Bloqueio de ES
• 2 sítios ativos ? I se fixa no complexo ES
• ESI não forma P
• Vmáx ? e Km ?

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Inibidores Incompetitivos

• Equação da velocidade
• Lineweaver-Burke

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Inibidores Incompetitivos
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Inibidores Irreversíveis

• Combinam-se com um grupo funcional ? destruição
• União covalente ? inibidor e enzima.
• Vmáx ? e Km

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Inibidores Irreversíveis

• Equação de Michaelis e Menten

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Inibidores Irreversíveis

• Lineweaver-Burk

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Influência do pH

• Valor de pH ótimo atividade máxima
• Velocidade da reação ? pH afasta do ótimo
• Influência do pH análise dos grupos
  dissociáveis
• Ácidos (Brönsted) compostos capazes de
  dissociar-se, liberando H.

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Influência do pH

• HA ? A H
• pH ? ? HA ? ? A ?
• Aminoácidos
• pH ? ? -COO- captam prótons -COOH
• pH ? ? -NH3 são dissociados NH2
• Ligação eletrostática -COO- -- NH3.

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Influência do pH

• pH ótimo depende do número e tipo de grupos
  ionizáveis ? estrutura primária
• Variações do pH ? afeta substrato com grupos
  ionizáveis
• Estabilidade da enzima temperatura, força
  iônica, concentração de substratos ou cofatores
  da enzima e concentração da enzima, entre outros.

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Influência do pH

• pH 5 e 8 não afeta a atividade
• Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 forma iônica
  não adequada
• 5 gt pH gt 8 inativação irreversível.

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Influência da Temperatura

• ? T ? ? velocidade de reação ? energia
  cinética
• T muito elevadas desnaturação da enzima
• Rompidas as pontes de hidrogênio ? alterações
  estruturas nova conformação
• T desnaturação ? pouco acima da T ótima.

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Influência da Temperatura

• Enzimas ? PM ? 1 cadeia polipeptídica e pontes
  dissulfeto estáveis ao calor
• Efeito da T pH, força iônica e a presença ou
  ausência de ligantes
• Substratos protegem a enzima da desnaturação.

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Influência da Temperatura

• K é função ? da T ? Lei de Arrhenius

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Influência da Temperatura

• Enzimas são termolábeis ? reação enzimática
  inativação términa
• Efeito da T na velocidade das reações ?
  coeficiente de temperatura
• Velocidade ? quando a T ? 10ºC.

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Regulação da Atividade

• Sistema enzimático produto da reação da 1ª
  enzima ? substrato da enzima subseqüente
• Enzimas reguladoras ? determina a velocidade da
  seqüência
• Atividade catalítica ? ou ? ? sinais
• Moléculas sinalizadoras ? pequenos metabólitos
  ou cofatores.

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Enzimas Alostéricas

• Ligação não-covalente e reversível ? modulador
• Inibição por retroalimentação
• Enzima reguladora ? inibida pelo P final da via ?
  reequilibra as necessidades celulares
• Moduladores inibidores ou estimuladores.

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Enzimas Alostéricas

• Modulador substrato ? homotrópicas
• Modulador ? substrato ? heterotrópicas
• Sítio alostérico ? específico para o modulador
• Curva de saturação sigmóide ? subunidades
  múltiplas.

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Enzimas Alostéricas

• ? curvas de variação de atividade ? moduladores
  inibidores, ativadores ou os dois tipos.

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Modificação Covalente

• Ligação covalente de um grupo químico à sua
  estrutura
• Metabolismo alterado ? aciona vias inativas e
  inibem vias ativas.