Polimer

1
Polimeráz láncreakció (PCR)

• Készítette Lakatos Valéria
• Biológia-Háztartásökonómia
• szakos hallgató
• III. évfolyam

2
A polimeráz láncreakció

• Angol név Polymerase Chain Reaction (PCR)
• K. Mullis- 1985
• Elonye az óriási sokszorozó képessége
• Molekuláris biológiai alkalmazásai
• DNS próbák eloállítás hibridizációhoz
• Módosított DNS eloállítása
• Klónozás
• DNS szekvenálásához minta elokészítése
• Genetikai betegségek kimutatása
• Fertozést okozó élolények detektálása betegtol
  vett mintákból
• Igazságügyi orvostani vizsgálatok
• Rokonsági viszonyok, stb.

3
A PCR elve

• A DNS függo polimeráz (primer DNS szál
  megkettozését végzo enzimek) reakciót két
  megfelelo oligonukleotid primer jelenlétében
  többször megismételve az eredeti DNS szekvencia
  egy része megsokszorozható. Ehhez szükség van DNS
  targetre, DNS polimerázra és két olyan
  oligonukleotid primerre, amely a DNS két szálával
  hibridizálnak úgy, hogy a 3 végük egymással
  szembenéz.

4
A reakció lépései

• 1. A kettosszálú DNS denaturálása hokezeléssel
  (95 Celsius fok)
• 2. A targettel komplementer két oligonukleotid
  hibridizálása az egyes DNS szálakhoz úgy, hogy az
  egyikük az egyik, másikuk a másik szálhoz
  kötodjön. A kapcsolat stabilizálásához az elegyet
  le kell huteni és az oligonukleotidokat nagy
  feleslegben kell alkalmazni
• 3. Új DNS szálak szintézise dNTP és DNS polimeráz
  segítségével
• 4. A ciklus megismétlése. Ekkor a sokszorozandó
  DNS szakasz megduplázódik

5
(No Transcript)
6
Plató effektus

• Kb. 106-szoros sokszorozás
• Exponenciális növekedés leáll
• Magyarázat DNS olyan mértékben koncentrálódik,
  hogy gyakoribb a hosszú szálak renaturálódása
  mint az oligonukleotiddal történo hibridizáció

7
(No Transcript)
8
Egy tipikus PCR ciklus homérsékleti profiljai

1. Denaturálás 92-95 Celsius fokon
2. Primerek hibridizálása az oligonukleotidok
   olvadáspontjától függo homérsékleten
3. DNS szintézis 72 Celsius fokon
4. Újabb hodenaturálás

9
(No Transcript)
10
Optimalizálás

• Legfontosabb tényezok
• 20-30 nukleotid hosszúságú primerek tervezése
• Optimális reakcióközeg beállítása
• Nagy tisztaságú dNTP oldatok használata
• Elvileg egyetlen kettos szálú DNS molekula
  elegendo a másolás beindításához, de ekkor
  magasabb ciklus szám szükséges
• Rendkívül fontos a szennyezések és
  keresztszennyezések elkerülése (nem kívánatos
  szennyezo DNS sokszorosítása)

11

• Felmerülo problémák
• A Taq polimeráz nem rendelkezik ellenorzo
  aktivitással
• Primerek aspecifikus kötodése félrevezeto
  eredmény
• A primerek összekapcsolódásával un. primer dimer
  keletkezhet
• Alkalmazásának korlátot szab, hogy csak akkor
  használható, ha már van megbízható szekvencia
  információnk vagy a nukleinsav vagy a fehérje
  szintjén

12
PCR alkalmazásai

• Fertozo ágensek kimutatása
• Szövetminta in situ vizsgálata
• Kettos szálú DNS megsokszorozása
• mRNS átalakítása cDNS-sé, ennek megsokszorozása
• Fehérjék meghatározása immundetektálás
  specifitásával ötvözve
• Mutációk detektálása

13
PCR szerepe a DNS szekvenálásban

• Aszimmetrikus PCR.
• Lényege a primereket nem 11 arányban
  alkalmazzuk, hanem az egyik primert 100x-os
  feleslegben visszük be a reakcióközegbe. Ilyenkor
  a PCR sokszorozás addig tart, amíg a kisebb
  koncentrációjú primer el nem használódik, ezt
  követoen csak a feleslegben jelenlévo primer
  muködik, így a szintézis egyszálú termékhez
  vezet.

14
Irányított mutagenézis

• A PCR primerek és a target DNS szekvenciája nem
  kell, hogy szükségszeruen 100-ig komplementer
  legyen. Lehetoség van eltéro szekvenciák
  beépítésére. Ezek a szekvenciák a sokszorosított
  DNS részévé válnak és maguk is sokszorozódnak.

15
Új restrikciós hely kiépítése

• PCR segítségével a sokszorozott szekvencia
  végére olyan restrikciós helyet építhetünk be,
  amely a természetes DNS-ben fordul elo. Ez akkor
  elonyös, ha a termék végét restrikciós enzim
  kezeléssel ragadóssá akarjuk tenni pl. klónozás
  céljából.

16
(No Transcript)
17
G-C kapocs készítése

• A PCR reakció egyik primerjének 5 végére G és C
  gazdag mesterséges szekvencia illesztheto. Ez
  eros hidrogénhíd kapcsolatot hoz majd létre. A
  PCR termék a natív DNS szakaszhoz képest
  stabilabban kapcsolódik össze. Denaturáló
  gradiens során a PCR termék nem esik szét.
  Felhasználható pontmutációk detektálásának
  érzékennyé tételére.

18
Pontmutáció létrehozása

• Az oligonukleotidban tudatosan beépíthetünk egy,
  a target szekvenciával nem komplementer
  nukleotidot, és így jól meghatározott helyen
  pontmutációt idézhetünk elo.

19
(No Transcript)
20
Egyéb módszerek

• Géntechnológiai manipulációk (inzerció, deléció,
  rekombináció)
• Módosított nukleutidok beépítése
• Részben vagy egyáltalán nem ismert DNS
  szekvenciák sokszorozása
• cDNS végek gyors erosítése (RACE)
• Szomszédos DNS szakaszok sokszorozása
• RNS kvantitálási módszerei (Northern analízis, In
  situ hibridizáció, Rnasa protection assay,
  microarray, Reverz traszkriptciós PCR)

21
Összegzés

• A fenti példákkal illusztráltam a PCR
  sokoldalúságát. A fejlesztés még korán sem zárult
  le, újabb és újabb technikákat vezetnek be
  különleges és speciális problémák megoldására.
  Mindez azt bizonyítja, hogy a Mullis által
  felfedezett egyszeru sokszorozási reakció dönto
  befolyást gyakorolt a molekuláris biológia
  módszertanára.

22
(No Transcript)
23
(No Transcript)
24
(No Transcript)
25
(No Transcript)
26
Köszönöm a figyelmet!