ASAM NUKLEAT

1
ASAM NUKLEAT

• BAMBANG HERU BUDIANTO

2

• Asam nukleat adalah suatu polimer nukleotida yg
  berperanan dlm penyimpanan serta pemindahan
  informasi genetik (polinukleotida)
• Asam nukleat terdapat dlm 2 bentuk, yi. asam
  deoksiribosa (DNA) dan asam ribosa (RNA).
• Keduanya merupakan polimer linier, tidak
  bercabang dan tersusun dari subunit-subunit yg
  disebut nukleotida
• Pd sel eukariot, DNA terdapat di dlm nukleus,
  sedangkan pada sel prokariot, terdpt dlm
  sitoplasma atau nukleoid dan berfungsi sbg
  molekul hereditas atau pewarisan sifat.
• Molekul RNA disintesis dari DNA dan berperan dlm
  sintesis protein di dlm sitoplasma (ribosom)
• Satu nukleotida terdiri atas 3 bagian yi gula
  berkarbon 5 (pentosa), basa organik heterosiklik
  (mengandung karbon, nitrogen dan berbentuk datar)
  dan gugus fosfat bermuatan negatif, yg membuat
  polimer bersifat asam.
• Pada RNA gula pentosanya adalah ribosa, sedangkan
  pada DNA gula pentosanya mengalami kehilangan
  satu atom O pada posisi C nomor 2 sehingga
  dinamakan gula 2-deoksiribosa

3
(No Transcript)
4

• Basa N, baik pada DNA maupun pada RNA, dapat
  dikelompokkan menjadi dua golongan, yaitu purin
  dan pirimidin.
• Basa purin mempunyai dua buah cincin (bisiklik),
  sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai satu
  cincin (monosiklik).
• Pada DNA, dan juga RNA, purin terdiri atas adenin
  (A) dan guanin (G).
• Akan tetapi, untuk pirimidin ada perbedaan antara
  DNA dan RNA.
• Kalau pada DNA basa pirimidin terdiri atas
  sitosin (C) dan timin (T), pada RNA tidak ada
  timin dan sebagai gantinya terdapat urasil (U).
• Timin berbeda dengan urasil hanya karena adanya
  gugus metil pada posisi nomor 5 sehingga timin
  dapat juga dikatakan sebagai 5-metilurasil.
• Di antara ketiga komponen monomer asam nukleat
  tersebut di atas, hanya basa N-lah yang
  memungkinkan terjadinya variasi.

5

• Pada kenyataannya memang urutan (sekuens) basa N
  pada suatu molekul asam nukleat merupakan penentu
  bagi spesifisitasnya.
• Dengan perkataan lain, penggambaran suatu molekul
  asam nukleat hanya dengan menuliskan urutan
  basanya saja.
• Pada asam nukleat terbentuk ikatan glikosidik
  (glikosilik) dan fosfodiester
• Ikatan glikosidik terjadi karena adanya ikatan
  antara posisi 1 pada gula dengan posisi 9 (N-9)
  pada basa purin atau posisi 1 (N-1)
• Suatu basa yang terikat pada satu gugus gula
  disebut nukleosida. Sedangkan, nukleotida sendiri
  adalah nukleosida dengan sebuah atau lebih gugus
  fosfat
• Jadi, apabila gulanya adalah ribosa, maka
  nukleosidanya dapat berupa adenosin (rA),
  guanosin (rG), sitidin (rC), dan uridin (rU).
  Nukleotidanya akan ada empat macam, yaitu
  adenosin monofosfat (AMPasam adenilat), guanosin
  monofosfat (GMP as guarilat), sitidin monofosfat
  (CMPas sitidilat), dan uridin monofosfat (UMP
  as uridilat)

6

• Jika gula pentosanya adalah deoksiribosa seperti
  halnya pada DNA, nukleosidanya terdiri atas
  deoksiadenosin (dA), deoksiguanosin (dG),
  deoksisitidin (dC), dan deoksitimidin (dT).
• Sedangkan, nukleotidanya masing-masing adalah
  deoksiadenosin monofosfat (dAMPas
  deoksiadenilat) deoksiguanosin monofosfat
  (dGMPas deoksiguanilat) deoksisitidin
  monofosfat (dCMPas deoksisitidilat) dan timidin
  monofosfat (TMPas timidilat)
• Pada asam nukleat terdapat pula ikatan kovalen
  melalui gugus fosfat yang menghubungkan antara
  gugus hidroksil (OH) pada posisi 5 gula pentosa
  dan gugus hidroksil pada posisi 3 gula pentosa
  nukleotida berikutnya. Ikatan ini dinamakan
  ikatan fosfodiester karena secara kimia gugus
  fosfat berada dalam bentuk diester
• Basa purin dan pirimidin tidak berikatan secara
  kovalen satu sama lain
• Oleh karena itu, suatu polinukleotida tersusun
  atas kerangka gula-fosfat yang berselang-seling
  dan mempunyai ujung 5-P dan 3-OH.
• Adanya ujung-ujung tersebut menjadikan rantai
  polinukleotida linier mempunyai arah tertentu.

7
(No Transcript)
8

• Telah dijelaskan bahwa penggambaran asam nukleat
  cukup dengan menuliskan urutan basa (sekuens)-nya
  saja
• Penulisan sekuens asam nukleat ada kebiasaan
  untuk menempatkan ujung 5 di sebelah kiri atau
  ujung 3 di sebelah kanan.
• Sebagai contoh, suatu sekuens DNA dapat
  dituliskan 5-ATGACCTGAAAC-3 atau suatu sekuens
  RNA dituliskan 5-GGUCUGAAUG-3.
• Sekuens tersebut juga menggambarkan arah
  pembacaannya
• Dua asam nukleat yang memiliki sekuens sama tidak
  berarti keduanya sama jika pembacaan sekuens
  tersebut dilakukan dari arah yang berlawanan
  (yang satu 5? 3, sedangkan yang lain 3? 5).
• Selain ikatan glikosidik dan fosfodiester, basa
  di dalam nukleotida membentuk ikatan hidrogen.
• Adenin akan membentuk 2 ikatan hidrogen dengan
  timin pada untai komplementer DNA double helix.
• Guanin membentuk 3 ikatan hidrogen dengan sitosin

9

• Adanya ikatan hidrogen tersebut menjadikan kedua
  rantai polinukleotida terikat satu sama lain dan
  saling komplementer. Artinya, begitu sekuens basa
  pada salah satu rantai diketahui, maka sekuens
  pada rantai yang lainnya dapat ditentukan.
• DNA terdapat dlm bentuk heliks ganda (double
  helix) yg seragam dengan rantai-rantai
  komplementer yg berpilin satu sama lain membentuk
  tangga spiral ke arah kanan, sedangkan
  molekul-molekul RNA disintesis dari cetakan DNA
  sebagai untai tunggal.
• Namun, untai tunggal RNA juga dpt melipat ke
  rantainya sendiri dan membentuk pasangan basa
  komplementer yg menghasilkan struktur sekunder yg
  unik
• Ke dua untai komplementer dari heliks ganda DNA
  bekerja dengan arah yg berlawanan atau
  antiparalel.
• Jika salah satu rantai dibaca dari ujung fosfat
  5-nya, maka rantai lainnya akan dibaca dari
  ujung hidroksilnya 3-nya.
• 3? membawa gugus OH bebas pada posisi 3? dari
  cincin gula, dan ujung 5?membawa gugus fosfat
  bebas pada posisi 5? dari cincin gula

10

• Heliks ganda DNA akan membawa satu putaran setiap
  10 pasangan basa (sekitar 3,4 nm)
• Basa yg berpasangan terletak di tengah molekul,
  membentuk rongga hidrofobik sehingga lebar heliks
  menjadi sekitar 2 nm
• Bentuk DNA tersebut dikatakan berada dalam bentuk
  B atau bentuk yang sesuai dengan model asli
  Watson-Crick.
• Bentuk yang lain, misalnya bentuk A, akan
  dijumpai jika DNA berada dalam medium dengan
  kadar garam tinggi. Pada bentuk A terdapat 11
  pasangan basa dalam setiap putaran spiral.
• Selain itu, ada pula bentuk Z, yaitu bentuk
  molekul DNA yang mempunyai arah pilinan spiral ke
  kiri.
• Bermacam-macam bentuk DNA ini sifatnya fleksibel,
  artinya dapat berubah dari yang satu ke yang lain
  bergantung kepada kondisi lingkungannya.

11
(No Transcript)
12

• DNA dobel heliks dapat dikopi secara persis
  karena masing-masing untai mengandung sekuen
  nukleotida yang persis berkomplemen dengan sekuen
  untai pasangannya. Masing-masing untai dapat
  berperan sebagai cetakan untuk sintesis dari
  untai komplemen baru yang identik dengan pasangan
  awalnya.

13

• Telah dijelaskan sebelumnya bahwa untai tunggal
  RNA juga dpt melipat ke rantainya sendiri dan
  membentuk pasangan basa komplementer yg
  menghasilkan struktur sekunder yg unik (ikatan
  hidrogen dlm molekulnya sendiri intramolekuler).
  
• Adanya modifikasi struktur RNA menyebabkan adanya
  perbedaan fungsi
• Berdasarkan fungsinya, dikenal 3 jenis RNA yi RNA
  transfer (tRNA) RNA duta atau messenger (mRNA)
  dan RNA ribosom (rRNA)
• Struktur mRNA dikatakan sebagai struktur primer,
  sedangkan struktur tRNA dan rRNA dikatakan
  sebagai struktur sekunder
• t RNA mempunyai ukuran paling kecil (panjang
  75-80 nukleotida) dan berperan membawa asam amino
  ke ribosom untuk di-polimerisasi membentuk rantai
  polipeptida

14

• RNA ribosom merupakan komponen struktural dari
  ribosom
• RNA duta membawa sekuens ribonukleotida hasil
  transkripsi kode genetik pada salah satu untai
  DNA sehingga panjang dan komposisi mRNA sangat
  bervariasi
• Sifat-sifat fisika-kimia asam nukleat meliputi
  stabilitas asam nukleat, pengaruh asam, pengaruh
  alkali, denaturasi kimia, viskositas, dan
  kerapatan apung.
• Stabilitas asam nukleat ditentukan oleh interaksi
  penempatan (stacking interactions) antara
  pasangan-pasangan basa. Artinya, permukaan basa
  yang bersifat hidrofobik menyebabkan
  molekul-molekul air dikeluarkan dari sela-sela
  perpasangan basa sehingga perpasangan tersebut
  menjadi kuat.
• Di dalam asam pekat dan suhu tinggi, misalnya
  HClO4 dengan suhu lebih dari 100ºC, asam nukleat
  akan mengalami hidrolisis sempurna menjadi
  komponen-komponennya. Namun, di dalam asam
  mineral yang lebih encer, hanya ikatan glikosidik
  antara gula dan basa purin saja yang putus
  sehingga asam nukleat dikatakan bersifat apurinik

15

• Pengaruh alkali terhadap asam nukleat
  mengakibatkan terjadinya perubahan status
  tautomerik basa.
• Sebagai contoh, peningkatan pH akan menyebabkan
  perubahan struktur guanin dari bentuk keto
  menjadi bentuk enolat karena molekul tersebut
  kehilangan sebuah proton.
• Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan
  terputusnya sejumlah ikatan hidrogen sehingga
  pada akhirnya rantai ganda DNA mengalami
  denaturasi.
• Hal yang sama terjadi pula pada RNA. Bahkan pada
  pH netral sekalipun, RNA jauh lebih rentan
  terhadap hidrolisis bila dibadingkan dengan DNA
  karena adanya gugus OH pada atom C nomor 2 di
  dalam gula ribosanya.
• Sejumlah bahan kimia diketahui dapat menyebabkan
  denaturasi asam nukleat pada pH netral.
• Contoh yang paling dikenal adalah urea (CO(NH2)2)
  dan formamid (COHNH2). Pada konsentrasi yang
  relatif tinggi, senyawa-senyawa tersebut dapat
  merusak ikatan hidrogen. Artinya, stabilitas
  struktur sekunder asam nukleat menjadi berkurang
  dan rantai ganda mengalami denaturasi.

16

• Molekul DNA sangat rentan terhadap fragmentasi
  fisik karena relatif kaku sehingga larutan DNA
  mempunyai viskositas yang tinggi
• Analisis dan pemurnian DNA dapat dilakukan sesuai
  dengan kerapatan apung (bouyant density)-nya.
• Di dalam larutan yang mengandung garam pekat
  dengan berat molekul tinggi, misalnya sesium
  klorid (CsCl) 8M, DNA mempunyai kerapatan yang
  sama dengan larutan tersebut, yakni sekitar 1,7
  g/cm3.
• Jika larutan ini disentrifugasi dengan kecepatan
  yang sangat tinggi, maka garam CsCl yang pekat
  akan bermigrasi ke dasar tabung dengan membentuk
  gradien kerapatan. Begitu juga, sampel DNA akan
  bermigrasi menuju posisi gradien yang sesuai
  dengan kerapatannya.
• Teknik ini dikenal sebagai sentrifugasi seimbang
  dalam tingkat kerapatan (equilibrium density
  gradient centrifugation) atau sentrifugasi
  isopiknik.

17

• Dengan teknik sentrifugasi tersebut DNA, RNA, dan
  protein akan terpisah.
• Pelet RNA akan berada di dasar tabung dan protein
  akan mengapung sehingga DNA dapat dimurnikan,
  baik dari RNA maupun protein.
• Selain itu, teknik tersebut juga berguna untuk
  keperluan analisis DNA karena kerapatan apung DNA
  (?) merupakan fungsi linier bagi kandungan
  GC-nya.
• Dalam hal ini, ? 1,66 0,098 (G C).
• Selain sifat fisik-kimia di atas, sifat
  spektroskopik-termal asam nukleat meliputi
  kemampuan absorpsi sinar UV, hipokromisitas,
  penghitungan konsentrasi asam nukleat, penentuan
  kemurnian DNA, serta denaturasi termal dan
  renaturasi asam nukleat.

18
Sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan
protein
sentrifugasi
CsCl 8M
DNA
RNA
19

• Asam nukleat dapat mengabsorpsi sinar UV karena
  adanya basa nitrogen yang bersifat aromatik
• Panjang gelombang untuk absorpsi maksimum baik
  oleh DNA maupun RNA adalah 260 nm atau dikatakan
  ?maks 260 nm.
• Meskipun ?maks untuk DNA dan RNA konstan, namun
  ada perbedaan nilai absorbansi (hipokromisitas).
• Molekul dsDNA dikatakan relatif hipokromik
  (kurang berwarna) bila dibandingkan dengan ssDNA.
  Sebaliknya, ssDNA dikatakan hiperkromik terhadap
  dsDNA.
• Konsentrasi DNA dihitung atas dasar nilai
  A260-nya
• Molekul dsDNA dengan konsentrasi 1 mg/ml
  mempunyai A260 sebesar 20, sedangkan konsentrasi
  yang sama untuk molekul ssDNA atau RNA mempunyai
  A260 lebih kurang sebesar 25.
• Nilai A260 untuk ssDNA dan RNA hanya merupakan
  perkiraan karena kandungan basa purin dan
  pirimidin pada kedua molekul tersebut tidak
  selalu sama, dan nilai A260 purin tidak sama
  dengan nilai A260 pirimidin. Pada dsDNA, yang
  selalu mempunyai kandungan purin dan pirimidin
  sama, nilai A260 -nya sudah pasti.

20

• Tingkat kemurnian asam nukleat dapat diestimasi
  melalui penentuan nisbah A260 terhadap A280
• Molekul dsDNA murni mempunyai nisbah A260 /A280
  sebesar 1,8.
• Sementara itu, RNA murni mempunyai nisbah A260
  /A280 sekitar 2,0.
• Nisbah protein (?maks 280 nm) , kurang dari
  1,0.
• Oleh karena itu, suatu sampel DNA yang
  memperlihatkan nilai A260 /A280 lebih dari 1,8
  dikatakan terkontaminasi oleh RNA.
• Sebaliknya, suatu sampel DNA yang memperlihatkan
  nilai A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan
  terkontaminasi oleh protein
• Selain bahan-bahan kimia, panas juga dapat
  menyebabkan denaturasi asam nukleat
• Denaturasi termal pada DNA dan RNA ternyata
  sangat berbeda

21

• Pada RNA denaturasi berlangsung perlahan dan
  bersifat acak karena bagian rantai ganda yang
  pendek akan terdenaturasi lebih dahulu daripada
  bagian rantai ganda yang panjang.
• Pada DNA, denaturasi terjadi sangat cepat dan
  bersifat koperatif karena denaturasi pada kedua
  ujung molekul dan pada daerah kaya AT akan
  mendestabilisasi daerah-daerah di sekitarnya.
• Suhu ketika molekul asam nukleat mulai mengalami
  denaturasi dinamakan titik leleh atau melting
  temperature (Tm).
• Nilai Tm merupakan fungsi kandungan GC sampel
  DNA, dan berkisar dari 80 ºC hingga 100ºC untuk
  molekul-molekul DNA yang panjang
• DNA yang mengalami denaturasi termal dapat
  dipulihkan (direnaturasi) dengan cara didinginkan
  
• Renaturasi yang terjadi antara daerah
  komplementer dari dua rantai asam nukleat yang
  berbeda dinamakan hibridisasi.

22

• Banyak molekul dsDNA berada dalam bentuk sirkuler
  tertutup atau closed-circular (CC), misalnya DNA
  plasmid dan kromosom bakteri serta DNA berbagai
  virus.
• Artinya, kedua rantai membentuk lingkaran dan
  satu sama lain dihubungkan sesuai dengan
  banyaknya putaran heliks (Lk) di dalam molekul
  DNA tersebut.
• Banyaknya putaran heliks yang terbentuk akan
  mengunci sistim pilinan tersebut. Deformasi
  inilah yang disebut sebagai superkoiling.
• Geometri suatu molekul yang mengalami
  superkoiling dapat berubah akibat beberapa faktor
  yang mempengaruhi pilinan internalnya
• Sebagai contoh, peningkatan suhu dapat menurunkan
  jumlah pilinan, atau sebaliknya, peningkatan
  kekuatan ionik dapat menambah jumlah pilinan
• Contoh keberadaan interkalator seperti etidium
  bromid (EtBr) yang menyisip di antara
  pasangan-pasangan basa