Polimer

1
Polimeráz láncreakció

• Készítette Feigl Viktória

2
PCR (polymerase chain reaction)

• A speciális, kiválasztott DNS szekvencia
  amplifikációja enzimes reakciók ismétlodésével in
  vitro körülmények között.
• Szelektív módszer, elonye a hagyományos
  technikákkal szemben, hogy speciális DNS fragment
  vizsgálatát teszi lehetové.
• Minden egyes PCR ciklusban a DNS mennyisége a
  reakcióelegyben megduplázódik, azaz 30 ciklus
  után 109-szerese a kezdeti DNS mennyiségnek.
• A reakció végterméke gélelektroforézissel
  vizsgálható.

3
PCR története

• Kary B.Mullis (Cetus) fedezte fel 1983-ban
• 1985-ben jelent meg a cikk
• 1993-ban kémiai Nobel-díj
• Ötlet olyan eljárást kellene kifejleszteni,
  amely a DNS-t mesterségesen megsokszorozza a
  DNS-polimeráz enzim segítségével, megismételt
  duplikációs ciklusok által.

4

• A DNS polimeráz enzim
• Megtalálható az élo szervezetekben
• Funkciója a DNS lemásolása a sejt osztódásakor
• A DNS egyik szálához kötodve létrehozza a
  komplementer szálat.
• Az eredeti eljárás
• A kettos szálú DNS két szálra választása 96C-ra
  történo hevítéssel

5

• 96C-on a DNS polimeráz lebomlott
• enzimet minden ciklusban pótolni kellett
• Kevéssé hatékony
• Idoigényes
• Nagy DNS-polimeráz fogyasztás
• Folyamatos figyelem
• Megoldás Thermus aquaticus
• Yellowstone Parkban izolálták (1969)
• Thomas Brock és Hudson Brock fedezte fel

6

• Magas homérsékleten stabilis DNS-polimeráz nem
  bomlik le a hevítési lépésben, nem szükséges
  minden ciklusban újat hozzáadni
• Eljárás leegyszerusödése
• Automatizálhatóság

7

• Taq polimeráz
• 1976-ban izolálták a T. aquatcus-ból
• Homésékleti optimuma 80C
• Hátránya hibázik, mutációk
• Nem rendelkezik 3?5 hibajavító exonukleáz
  aktivitással
• Helyette Archea
• Pfu, Pwo, de lassabbak
• Megoldás Taq és Pfu kombinációja (gyors és
  pontos)

8
Mire van szükség a PCR reakcióhoz?

• DNS-templát vagy cDNS ez tartalmazza a
  DNS-szakasz amplifikálandó régióját
• Két primer amely meghatározza az amplifikálandó
  szakasz elejét és végét
• DNS-polimeráz amely lemásolja az amplifikálandó
  szakaszt
• Nukleotidok amelyekbol a DNS-polimeráz felépíti
  az új DNS-t
• Puffer amely biztosítja a DNS-polimeráz számára
  megfelelo kémiai környezetet

9
A primerek

• Segítségükkel határozható meg az amplifikálandó
  DNS szakasz
• Komplementerek az amplifikálandó DNS szakasz
  elejével és végével
• Rövid, mesterséges DNS szálak
• Hosszuk 17-30 bp
• Nem tartalmaznak komplementer régiót (egymással
  nem képeznek primer-dimert)

10
Primertervezés

• Optimális olvadási homérséklet 60-75 C
• Olvadási homérséklet Ahol a primer kötohelyeinek
  fele foglalt
• No a primer hosszával
• Túl magas (80C felett) DNS polimeráz kevéssé
  aktív limitált hossz
• Legtöbb primer GC tartalma gt50 ? magasabb
  olvadáspont
• Két primer egyezo olvadási T ? nem specifikus
  termékek elkerülése és mindkét primer felol
  azonos amplifikáció
• Rövid primerek több helyre kapcsolódhatnának
  ?nem specifikus kópiák
• Optimális hossz 20-40 nukleotid
• Specifikus gén vagy egy adott mikroorganizmus faj
  detektálásához A keresett DNS-re specifikus
  primer, amely kizárólag a target szekvenciához
  kapcsolódik
• Mikroorganizmus csoport detektálásához DNS
  konzervált régiójára tervezni

11
Degenerált primerek

• Hasonló, de nem azonos primerek keverékei
• Ha ugyanazt a gént különbözo organizmusokból kell
  amplifikálni (hasonló, de nem azonos gének)
• Ha a tervezésnél a fehérjeszekvenciát veszik
  figyelembe (egy aminosav több kódon)
• Csökkentik a PCR amplifikálás specifitását
• Problémát részben megoldja a Touchdown PCR

12
PCR eljárás

• 1. Denaturáció (94-96C, 1-2 perc)
• A két DNS szálat összeköto H-hidak felbomlanak
  (1. ciklus elott hosszabb denaturálás a teljes
  szeparációhoz)
• 2. Primertapadás / annealing (55-60C, 1-2 perc)
• A primerek hozzákapcsolódnak a DNS szálakhoz
• Hom. ált. 5C-kal van a primerek olvadási
  homérséklete alatt
• 3. Lánchosszabbítás (72C, 1-2 perc)
• A DNS-polimeráz létrehozza a hiányzó szálat
• T és t függ a DNS-polimeráztól, t az
  amplifikálandó szakasz hosszától (ált. 1000
  bp/perc)
• Utolsó ciklus után hosszabb lánchosszabbítás

13

• A PCR-ciklus sematikus ábrája.
• Denaturálás
• Primertapadás
• Meghosszabbítás (Ppolimeráz).
• Az elso ciklus véget ért. Az eredményül kapott
  két DNS-szál a következo ciklus templátja lesz,
  azaz minden ciklusban megkétszerezodik a DNS
  mennyisége.

14
Detektálás - Gélelektroforézis
A PCR-termék összehasonlítva a DNS-létrával
agargélen. A DNS-létra (1. sáv), a PCR-termék
alacsony koncentrációban (2. sáv) és magas
koncentrációban (3. sáv) Helmut W. Klein,
Biokémiai Intézet, Kölni Egyetem, Németország
15
Nested PCR

• Nem specifikus primerkötések, azaz nem kívánt
  termékek (szennyezodés) kiküszöbölésére.
• Két sorozat primer két egymást követo PCR
  reakcióban. A második primerpár (nested primer)
  az elso reakció termékén belül köt (fészkel).
• Elv Ha az elso primer rossz helyre köt, nagyon
  kicsi az esélye, hogy a másodiknak is legyen nem
  kívánt kötohelye, azaz ezután is legyen nem
  kívánt termék.

16
Touchdown PCR

• A specifitás növelésére
• Elv a primertapadás homérséklete meghatározza
  annak specifitását alacsonyabb homérsékleten a
  primer kevésbé specifikusan köt
• A kezdeti homérséklet a primerek olvadási jóval
  homérséklete (Tm) fölött van
• A homérsékletet ciklusonként 1-2 C-kal
  csökkentik a primer a leheto legmagasabb, még
  elviselheto homérsékleten fog tapadni, itt a
  legnagyobb a specifitás
• Késobb ezek a fragmensek amplifikálódnak tovább,
  elnyomva a nem specifikus termékeket
• A homérséklet fokozatosan csökken a primer Tm-hez
  (touchdown homérséklet, ideális), utána itt
  folytatódik a primertapadás további 10 vagy több
  cikluson át

17
Inverz PCR

• Ha a target szakaszon belül ismert egy szekvencia
  a két szélén nem
• Emésztés (kis szakaszokra)? önligálás (cirkuláris
  forma) ? hasítás restrikckiós enzimmel az ismert
  szekvencián belül ? ismert két szélso szekvencia
  ? PCR
• Szélen elhelyezkedo transzpozonok és genomikus
  inzerciók identifikálására

18
Reverz Transzkripció PCR (RT-PCR)

• RNS amplifikációjára

• Alkalmazások
• Kis mennyiségben jelen lévo RNS-ek detektálása
• cDNS könyvtárak létrehozása

Reverz transzkripció primerje oligo dT, ami az
RNS 3 végének poliA szekvenciájához köt
(helyette lehet random hexamer vagy specifikus
primerek) RT 37 C, 1 óra RNS lebontása
RNázH-val cDNS komplementer szálának
szintetizálása magasabb T-n
19
Real-Time PCR
Video

• Kvantitatív módszer!
• Minden PCR ciklus után megadja a DNS mennyiségét
  real-time
• Fluoreszcens festék a kettos szálú DNS-hez
  köt
• DNS oligonukleotid próba a kiegészíto szálhoz
  kötve fluoreszkál
• Gyakran a Reverz Transzkripció PCR-ral együtt
  használják kis mennyiségu RNS (mRNS)
  mennyiségének meghatározására a gén expresszió
  szintjének mérése
• Hagyományos módszer Northern blotting,
  hátránya, hogy csak nagy mennyiségu RNS esetén
  muködik

20
Fluoreszcens festék

• SYBR Green
• - Kétszálú DNS-hez köt (egyszálúhoz és
  primerhez nem) miután a DNS-polimeráz
  megszintetizálta a 2. szálat, fluoreszkál ?
  detektorral mérheto
• Standard hígítási sorhoz hasonlítva mérheto a
  mennyiség
• Relatív mennyiséget ad meg
• Hátrány Nem sepcifikus PCR termékekhez is köt,
  Elony Relatíve olcsó
• Cianid festék
• Kék fénnyel indukálható (?max 488 nm) zöld
  fényt bocsát ki (?max 522 nm)
• Mutagén etídium-bromid helyett használható
• Egyéb festékek
• SYBR Gold, YO (Oxazole Yellow),
• TO (Thiazole Orange), PG (PicoGreen)

21
Fluoreszcens oligonukleotid próba FRET módszer
Fluorescence (or Förster) Resonance Energy
Transfer

• Két fluorofór
• Zöld (rövid ?) reporter dye (jelzo), 5 végen,
  (gyakran GFP)
• Piros (hosszú ?) quenching dye (elnyomó), 3
  végen
• Az piros fluorofór elnyeli a zöld által
  kibocsátott fényt FRET által
• A próba hozzáköt a DNS-hez, majd a polimeráz
  muködése közben eltávolítja. Így a zöld fluorofór
  eltávolodik a pirostól és a kibocsátott fény
  mérheto.
• Elonye specifikus!
• Egyszerre több szekvencia is detektálható
  többféle színu festék használatával.

22
Molecular Beacon
TaqMan
Különbség A molecular beacon intakt marad,
minden ciklusban újra tud kötni. Denaturáció
során a hajtu szerkezet felbomlik, köt a DNS-hez
és fényt emittál, mivel a zöld fluorofór
eltávolodik a pirostól. (Ami nem köt az
visszanyeri a hajtu szerkezetet és inaktív.)
23
Mennyiségi meghatározás

• Minél nagyobb a kezdeti target DNS mennyisége,
  annál hamarabb észlelheto szignifikáns növekedés
  a fénykibocsátásban. A fix küszöbértéket egy
  adott ciklusban éri el a fluoreszcencia (CT
  cycle treshold), amit logaritmikus diagramon
  ábrázolva standard hígítási sorhoz viszonyítva
  meghatározható a kezdeti DNS mennyisége (relatív
  minták egymáshoz hasonlítása)

Felhasználás A gén transzkripció érzékeny
mennyiségi meghatározására. Diagnosztika
fertozo betegségek, rák, genetikai
rendellenességekben szerepet játszó gének gyors
detektálására. Génexpresszió változásának nyomon
követése Szövet vagy sejtkultúrák reakciója
gyógyszerekre, környezeti körülmények változására
indukált mutációk (környezeti mikrobiológia
rezisztens gének detektálása).
24
A PCR alkalmazásai

• Genetikai ujjlenyomat - személyek azonosítása
• Örökletes betegségek kimutatása
• Fertozo betegségek kimutatása fertozést okozó
  mikroorganizmus DNS-ének amplifikálása
  (immunválasz elmaradása vagy álpozitív eredmény
  esetén is)
• Osi DNS elemzése pl. mamut, egyiptomi múmiák
• Rokonság vizsgálat pl. apasági perek,
  evolúciókutatás
• Génklónozás