Akt

1
Rekombináns fehérjék termeltetési stratégiái
Két fo stratégia

• Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in
  vivo elofordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid
  hidak kialakuljanak
• ha a fehérje mérgezo a gazdasejtre, akkor eloször
  inaktív fehérjét állítunk elo,
• majd ezt aktiváljuk, ehhez kell az in vitro
  refolding

Az aktív forma esetén csak tisztítani kell a
fehérjét
2
REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK AKTÍV FORMÁBA VITELE
Három fo lépés   1. Az oldhatatlan inclusion
body-t szolubilizáljuk, alacsony vagy magas pH,
emelt homérséklet, detergensek, magas
koncentrációjú szervetlen sók, vagy szerves
oldószerek. A legelterjedtebbek urea, vagy
guanidin-hidroklorid, esetleg redukálószer
(pl. DTT) jelenlétében.   2. Refolding híg
fehérje oldattal - ha nincs diszulfid híd, akkor
a fehérje denaturálószer lassú eltávolítása - ha
diszulfid hidak vannak, akkor a renaturáció
mellett a diszulfid hidakat is ki kell
alakítani, szerkezet stabilizáló hatásuk van.
levegoztetés, tiol-diszulfid párok hozzáadása,
pH optimalizálása   3. Az aktív és inaktív
forma szétválasztása pl. affinittás
kromatográfia, preparatív SDS-PAGE, RP-HPLC, FPLC
stb.  
3
trp promoter alapú vektorok
- alaposan vizsgált, jósolható eredmény   - eros,
2-30 a rekombináns/összfehérje   -
alapállapotban alacsony expresszió, de toxikus
fehérjékre ez nem elég, pBR322 vektorban kb
50x-es indukció   - majdnem minden E. coli
sejtvonalban használható   - magas kópiaszámú
plazmidok nem használhatók, nincs elég trp
represszor  
Probléma triptofán elvonás az indukció egy
kissé nehézkes
4
Kétkomponensu trp alapú expressziós rendszer
Invitrogen
ptrp cI
Kromoszómán integrálva
5
T7 RNS polimeráz alapú vektorok
- T7 promoter nagyon szelektív, a gazdában nincs
ilyen promoter általában   - T7 RNS polimeráz 5x
gyorsabb, mint az E. coli-é, azaz már a
transzkript is domináns   Gazdasejtek Standard
klónozó vektorok klónozásra BL21 (F-, ompT-,
lon-) expresszióra, lizogén sejtváltozatok DE3
bakteriofág, immunitási régió, lacI gén, lacUV5
promoter lacZ eleje T7 RNS polimeráz génje,
integrálva kromoszómába   Nagyon toxikus fehérjék
esetén   pLysS, pLysE T7 lizozim természetes
inhibitora a T7 RNS polimeráznak, E. coli tudja
tolerálni, mert nem képes áthatolni a belso
membránon pACYC184 vektorba van beépítve, catr,
kompatibilis vektor pLysE nagy mennyiséget,
pLysS kevesebb mennyiséget termel (ellentétes
orientáció, tet promoter CE6 bakteriofág  tartalm
azza a T7 RNS polimeráz génjét, így az indukció
kívülrol bejuttatott gén
6
A pET vektorokon alapuló, indukálható fehérje
termelés elvi sémája
7
A pET rendszer
8
pET vektorok

• pBR322 származékok,
• ampicillin, vagy kanamicin rezisztensek
• ?10 promoter, a T7 fág ?10-es génjének (kapszid)
  eros promótere

1. Transzkripciós vektorok
T7 promoter van, de nincs transzlációs iniciációs
szignál különféle verziók, stop szignálok
bevitele vagy sem, fúziós partner esetleg a C
terminálison Visszaszorulóban vannak
T7lac promoteres változatok
Nagyon toxikus fehérjék esetén dupla
biztosítás a T7 promotertol startpont környékére
a lac operátor szekvencia klónozása, elegendo
lacI biztosítása, a vektorba beépítették
ellentétes irányban
9
Két transzkripciós vektor példa
10
Transzlációs vektorok

• ? 10 transzkripciós és transzlációs szignálok,
• mindegyik típusú egy sorozat különbözo
  leolvasási keretekkel
• Egy rövid fúzió az elso 10 aminosavval (g10),de
  NdeI-gyel elkerülheto. 
• Esetenként ? 206aa fúzió ? stabilitás

11
(No Transcript)
12
(No Transcript)
13
Plazmid stabilitási teszt
  lemezek ampicillin, IPTG, mindketto és egyik
sem Mik nonek fel? 1. egyik sem minden sejt 2.
ampicillin plazmid tartalmú sejtek, 3. IPTG
plazmid mentes sejtek, vagy expressziós
mutánsok 4. IPTG, amp. plazmid marad, de az
expressziós készség elveszett
14
ptac alapú vektorok pGEX sorozat
GST mindig N-terminális fúzióelvileg
szolubilizál Nem lehet denaturáltan tisztítani
15
Arabinóz alapú expressziós vektorok
Vektor felépítés
Szabályozás
Szekréciós vektor
Kontrollálhatóság
16
Fehérje termeltetés in vitro
In vitro transzláció

• Elonyei
• Oxidatív környezet
• Citotoxicitás elkerülése, farmakológiai
  alkalmazások
• Nincs membrán, a termék azonnal a reaktortérbe
  kerül
• gyors

• Hátrányai
• Drága
• Kitermelés korlátozott

Két fo stratégia
RNS polimerázzal sejt extraktummal
Tiszta komponensekbol
17
Az in vitro fehérjetermeltetés folyamatábrája
18
T7 alapú rendszerek
19
Az igazán in vitro rendszer
20
ATGGAACGCCGCTATTGCCATCGCATTAGCACCATGGCGAGCGCGAACGA
TCATGCGCCGCCGTATAACGAATGGTATGAAGCGCGCTAA
21
MERRY CHRISTMAS AND HAPPY NEW YEAR
1 atggaacgccgctattgccatcgcattagcaccatggcgagc m
e r r y c h r i s t m a s gcgaacgat
a n d catgcgccgccgtataacgaatggtatgaagcgcgctaa
h a p p y n e w y e a r -
22
(No Transcript)