Analisi di linkage

1
Analisi di linkage

• Vincenzo Nigro
• Dipartimento di Patologia Generale
• Seconda Università degli Studi di Napoli

Telethon Institute of Genetics and Medicine
(TIGEM)
2
Trasmissione Autosomica Dominante
50 dei figli manifestano il carattere senza
preferenza di sesso
75 dei figli manifestano il carattere senza
preferenza di sesso
3
Espressività Variabile
Espressività grado con il quale la malattia è
espressa in un individuo Il tipo e la gravità
delle manifestazioni cliniche non sono sempre
sovrapponibili negli individui affetti dalla
stessa patologia A.D.
VARIABILITA INTERFAMILIARE o INTRAFAMILIARE
Importanza di un accurato esame clinico esteso ai
consanguinei di un affetto, anche apparentemente
sani Nei figli di soggetti moderatamente affetti
la patologia può essere più grave (es. Sclerosi
tuberosa)
4
Espressivita variabile
SINDROME Un insieme di segni clinici
apparentemente non collegati, ma che si osservano
contemporaneamente nei pazienti, così di
frequente da essere riconosciuti come ununica
patologia
e tipica dei fenotipi dominanti, anche se la
recessivita potrebbe essere interpretata come
un effetto della espressivita variabile
il gene a meno che non sia deleto o
completamente inattivato, a livello molecolare
e sempre dominante il problema e avere i
mezzi per vederlo
al livello di popolazione un fenotipo presenta
espressivita variabile quando allinterno
dellinsieme di soggetti sicuramente portatori
il fenotipo presenta gravita e/o complessita
diversa. Anche allinterno della famiglia ci puo
essere espressivita variabile
5
Espressivita variabile

SINDROME DI WAARDENBURG

Sindrome completa sordita occhi di colore
diverso ciuffo di capelli bianchi sulla fronte
precoce incanutimento
1 sordita
2 sordita occhi di colore diverso
3 sordita occhi di colore diverso ciuffo di
capelli bianchi sulla fronte
4 ciuffo di capelli bianchi sulla fronte
precoce incanutimento
6
Trasmissione Autosomica Dominante
Esordio variabile
Il fenotipo puo comparire in eta avanzata
Il fenotipo non e congenito pur essendo
ereditario CONGENITO presente alla nascita
Dal punto di vista genetico raramente questi
fenotipi sono dovuti a nuove mutazioni
A livello di popolazione lallele mutato puo
essere frequente purche l insorgenza si
verifichi dopo linizio delleta riproduttiva
e non limiti la fitness
FITNESS IDONEITA BIOLOGICA, piu semplicemente
capacita di riprodursi
7
Trasmissione Autosomica Dominante Penetranza
Incompleta

• Penetranza proporzione di individui portatori
  del gene patologico che hanno segni clinici della
  malattia
• Può dipendere
• accuratezza diagnostica
• (esami clinici e di laboratorio mirati - es.
  porfiria acuta)
• età
• (esordio variabile - es.Corea di Huntington)
• meccanismo dazione del gene
• (Retinoblastoma, teoria dei 2 hits di Knudson)

8
Penetranza
La penetranza e quindi un concetto che si
riferisce alla popolazione. A livello del singolo
individuo il carattere ha solo due possibilita
si manifesta o non si manifesta. E piu
frequente nei caratteri dominanti
Sapere che un gene puo non essere completamente
penetrante, e critico per studiarne la genetica
o fornire consulenza genetica un certo soggetto
che non manifesta il carattere puo essere
portatore del gene.
E critico percio il livello di indagine
9
Età di insorgenza della Corea di Huntington

1. Probabilità che un individuo portatore del gene
   mutato abbia sviluppato i sintomi ad una data età
2. Rischio che il figlio sano di un soggetto affetto
   sia portatore del gene mutato ad una determinata
   età.

10
Penetranza ed espressivita
La penetranza ridotta non e da confondere con
lespressivita variabile
Lespressivita e il grado di gravitacon cui
fra gli individui che presentano il fenotipo
questo si esprime puo costituire un
sottoinsieme degli individui penetranti
Es. Neurofibromatosi presenza di tumori lungo i
nervi periferici e regioni di pigmentazione scura
(macchie di caffelatte)Tutti i portatori
presentano almeno uno dei segni, ma la gravita
puo essere diversa anche allinterno della
stessa famiglia un genitore con macchie e
piccoli tumori cutanei benigni puo avere un
figlio che presenta tumori estesi e maligni.
(questa differenza non e prevedibile si puo
solo quantizzare il rischio di ereditare lallele
non il fenotipo)
11
ipotesi sul rischio di ricorrenza

1. La malattia non è genetica
2. La malattia è dovuta a nuova mutazione dominante
   rischi di ricorrenza trascurabili nella prole
   della coppia
3. La trasmissione è autosomica recessiva rischio
   di ricorrenza di 1 su 4 per la futura prole
   indipendentemente dal sesso
4. La malattia è legata allX recessiva e la madre
   può essere o meno portatrice rischio di
   ricorrenza di 1 su 2 maschi se la madre è
   portatrice
5. La malattia è poligenica o cromosomica rischio
   di ricorrenza ben definito dipendente dal tipo di
   malattia

12
mappaggio genico

• Serve ad identificare la posizione cromosomica di
  un locus genico
• Possono essere mappati
• marcatori genetici anonimi, quali brevi sequenze
  di DNA (dette STS), DNA microsatelliti, ecc.
• geni
• loci associati a malattie con trasmissione
  mendeliana
• loci associati a predisposizione a malattie con
  trasmissione nonmendeliana

13
a cosa serve il mappaggio in genetica medica?

• per identificare la localizzazione dei geni
  malattia
• per fare diagnosi indiretta in una famiglia in
  cui la mutazione responsabile di una malattia
  genetica mendeliana non è stata ancora
  identificata
• per identificare i geni responsabili della
  suscettibilità a malattie non mendeliane

14
per localizzare e identificare geni malattia
Linkage mapping
15
per fare diagnosi indiretta in una famiglia in
cui la mutazione responsabile di una malattia
genetica mendeliana non è stata ancora
identificata
16
per identificare i geni associati ad una
suscettibilità a malattie non mendeliane
17
Segregazione e crossing-over
un figlio riceve un cromosoma da ciascun genitore
che è il prodotto finale della ricombinazione
meiotica Non è possibile ricevere un cromosoma
che non abbia effettuato crossing-over
18
principi generali del mappaggio

• si segue la segregazione della patologia nei
  pedigrees utilizzando marcatori genetici a
  posizione nota
• si correla la segregazione della patologia e dei
  marcatori in più famiglie
• quanto più spesso la patologia e un marcatore
  co-segregano tanto più sono vicini

19
cè bisogno di famiglie abbastanza grandi in cui
si osserva la trasmissione della patologia
20
i membri della famiglia devono essere
genotipizzati usando marcatori polimorfici
marcatori polimorfici sono noti per ogni
cromosoma e di ciascuno si conosce esattamente la
posizione cromosomica i marcatori più informativi
sono quelli che presentano un elevato grado di
eterozigosità, perché questo consente di
distinguere lallele paterno dallallele materno
La nomenclatura D20S906 indica che un marcatore
di DNA è singolo nel genoma ed è localizzato sul
cromosoma 20 purtroppo il numero 906 non ha
alcun rapporto con la posizione
21
Marcatori polimorfici

• A partire dagli anni 80
• RFLP restriction fragment length polymorphisms
• Nella accezione attuale, il DNA purificato è
  amplificato con la PCR. Il prodotto della PCR è
  quindi tagliato in frammenti di restrizione
  mediante enzimi di restrizione detti
  endonucleasi, che attuano il taglio unicamente in
  corrispondenza di particolari sequenze
  nucleotidiche, specifiche per ogni enzima. I
  frammenti di restrizione sono separati per
  lunghezza mediante elettroforesi su gel d'agarosio

22
RFLP

• lenzima di restrizione SmaI taglia
  lesanucleotide CCCGGG. La sequenza CCGGGG rende
  non digeribile il DNA in quella posizione

23
STR

• A partire dal 1990
• STR short-tandem repeats or microsatellites
• e.g. (CAn)
• gttatcttagggctcagtcacacacacacacacacacacatccaggtat
  tggatcaac
• Quello che varia tra gli alleli è il numero di
  ripetizioni dellelemento. E molto più frequente
  riscontrare individui eterozigoti, con un numero
  di ripetizioni differente nei due alleli

24
ricombinanti R e non ricombinanti NR il 50 deve
essere R e il 50 NR se i loci sono posti su
cromosomi differenti, mentre i NR sono gt50 se i
loci sono sintenici.
25
Lanalisi della frazione di ricombinazione è alla
base del mappaggio

• la frazione di ricombinazione tra due loci, q, è
  compresa tra 0 e 0.5
• Il valore di q non può mai essere maggiore di
  0.5, il che indica che i loci sono posizionati
  molto lontani o su cromosomi differenti
• se q è significativamente minore di 0.5 i loci
  sono linked
• più piccolo è q più vicini sono i loci

26
(No Transcript)
27
lunità di misura della distanza genetica è il
centiMorgan cM

• La distanza genetica tra due loci è il numero
  atteso di crossovers per meiosi
• le distanze piccole sono accurate mentre le
  grandi sono sottostimate perché un doppio
  crossover può far pensare a un non ricombinante
• per valutare distanze grandi occorre sommare
  distanze piccole
• per q lt10 la correlazione tra q e cM è 11
• mediamente 1 cM corrisponde a circa 850.000 bp,
  ma tale valore è inversamente proporzionale alla
  frequenza di ricombinazione

28
Le meiosi si visualizzano con MLH1 che è parte
del macchinario di ricombinazione Nella meiosi
maschile che avviene nei testicoli ci sono circa
51 chiasmi e quindi considerando 50cM per
chiasma, il genoma è di 2550 cM Nella meiosi
femminile che è più difficile da studiare perché
avviene a 16-24 settimane di vita fetale ci sono
almeno 70 chiasmi (3500 cM), ma si stimano
4280cM Dal momento che la frequenza di
ricombinazione è differente si usa un valore
medio tra i due sessi
29
Il mappaggio per linkage è basato sullanalisi
della ricombinazione
affetto
non affetto
Locus malattia
Marker
D allele patologico d allele wild-type
30
1 obiettivo - stabilire la fase
Doppio eterozigote
31
2 obiettivo contare i ricombinanti
NR NR NR NR NR R
32
lod-score

• Il lod-score misura le probabilità a favore del
  linkage
• Compara la probabilità ad un certo valore di ? e
  la probabilità nel caso non vi sia alcun linkage
  e quindi che ? sia uguale a 0.5
• LOD log of the odds Z(?) log10 L(?)/L(0.5)

33
3 obiettivo calcolare il LOD score
NR NR NR NR NR R
LOD SCORE (LOD)
Z log10 ? R ( 1- ?) NR
log10 ? ( 1- ?) 5
0.5 6
0.5 (RNR)
34
Il metodo

• La probabilità L(q) è calcolata per i differenti
  valori di q tra 0 e 0.5
• Un rapporto tra le probabilità è calcolato LR(q)
  L(q)/L(0.50)
• Il lod-score è il logaritmo in base 10 log10 del
  rapporto tra le probabilità
• Z(q) log10L(q)/L(0.50)
• La migliore stima della frazione di
  ricombinazione è il valore di q a cui Z(q) è
  massimo (MLS)

35

• Per le patologie a trasmissione mendeliana
• Z(?) gtgt 3 ? si accetti il linkage per un
  carattere autosomico
• Z(?) gtgt2 ? si accetti il linkage per un carattere
  X-linked
• Z(?) lt -2 ? si respinga definitivamente lipotesi
  di linkage per un particolare valore di ?
• Z(?) gt -2 ma lt 3 ? occorrono ulteriori studi

36
linked, no recombination
37
Link utile
http//linkage.rockefeller.edu