1
AFLP, amplified fragment length polymorphism

• Alternativa k RAPD na bázi DNA fingerprintingu
  nabízí metoda AFLP (cesky polymorfismus délek
  amplifikovaných fragmentu) (Vos et al. 1995)
• Multilokusová analýza AFLP má mnohem vyšší
  schopnost rozlišení polymorfismu alel než metoda
  RFLP (Barker et al. 1999) a je velmi vhodnou
  technikou pro studium genetické variability na
  úrovni druhu ci populací u široké škálu organismu
  (napr. Liu et al. 1998, Wang et al. 2004, Uthicke
  et Conand 2005)
• možnost rychle vygenerovat velké množství
  polymorfních markeru i u druhu, o nichž nemáme
  jedinou predchozí genetickou informaci
• Princip metody technika AFLP kombinuje výhody
  osvedceného principu PCR (polymerase chain
  reaction) a štepení restrikcní endonukleázou pro
  získání specifických selektovaných restrikcních
  fragmentu celkové DNA jakéhokoli jedince, tedy
  napríc genomem, za vysoké míry opakovatelnosti
  pokusu.
• nevýhody dominantní marker s obcas nejistým
  puvodem a homologií fragmentu, financne dražší
  metoda, komplikovanejší protokol

2
AFLP, amplified fragment length polymorphism

• Využití
• vhodnost AFLP markeru pri studiu hybridizace,
  introgrese, definice klonu, polyploidu, stanovení
  genotypu (vyšší variabilita oproti konzervativním
  alozymovým lokusum)
• urcování paternity díky variabilite a vysoké míre
  reprodukovatelnosti výsledku
• systematika, fylogeneze, fylogeografie
• populacne-genetické studie vnitro- a
  mezipopulacní variabilita, kvantifikace genového
  toku, podobnost/rozdílnost mezi populacemi
• AFLP protokol na http//www.natur.cuni.cz/muncli
  ng/praktGM.htm
• (Projekt FRVŠ 813/2008)

3
AFLP, princip metody
1. restrikce specifické rozštepení celkové DNA
dvema restrikcními endonukleázami MseI -
rozpoznává 4bp dlouhou sekvenci (TTAA) a EcoRI
rozpoznává 6bp (GAATTC) ?velké množství
fragmentu, mají na jednom konci MseI a na druhém
EcoRI štepné místo 2. ligace T4 ligázou jsou
k fragmentum pripojeny specifické adaptory, tím
známe sekvence zacátku a koncu všech fragmentu
3. preselektivní amplifikace redukce
vysokého poctu fragmentu, PCR s primery
komplementární adaptorum, avšak o 1 bázi delší a
presahují tak "dovnitr" studovaného fragmentu,
namnoží se tak pouze 1/4 všech fragmentu (pouze
ty s komplementární bázi), tj. se 2 primery je
amplifikována pouze 1/16 fragmentu (1/4 x 1/4)
4. selektivní amplifikace další redukce s
primery se tremi selektivními nukleotidy
(presahy "dovnitr" studovaných fragmenty,
amplifikována je pouze 1/256 všech fragmentu
(1/16 x 1/16)       prevedení na 0-1
matici (presence/absence fragmentu), výpocet
párových koeficientu genetické vzdálenosti (Nei,
Jaccard...), konstrukce stromu pomocí UPGMA,
neigbour-joining.....    
   
 
 
5. visualizace a vyhodnocení s flourescencne
znaceným EcoRI primerem mužeme k
vyhodnocení fragmentu využít automatický
sekvenátor