Cromatograf

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Cromatografía
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Cromatografía
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Cromatografía
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Cromatografía
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Cromatografía
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Descubridor

• El botánico ruso Mikhail Tswett (Mikhail
  Semenovich Tsvett, 1872-1919)

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Definición

• Cromatografía es un método de separación en el
  que se aprovechan las diferencias en el
  comportamiento de partición entre una fase móvil
  y una fase estacionaria para separa los
  componentes de una mezcla.

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Cromatografía, definición (cont.)

• Una columna u otro soporte mantienen a la fase
  estacionaria y la fase móvil acarrea a la
  muestra.
• Los componentes de la muestra que particionan
  fuertemente con la fase estacionaria estarán más
  tiempo dentro de la columna.

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Si es en columna

• Conforme los componentes son eluidos de la
  columna, pueden ser cuantificados por un detector
  y colectados para análisis posterior

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Métodos cromatográficos

• De gases
• En capa fina
• En líquidos inmovilizados
• De exclusión molecular
• Intercambio iónico
• Hidroxiapatita
• Hidrofóbica
• Afinidad
• HPLC

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Exclusión molecular

• Fase estacionaria
• Dextrán con enlaces cruzados
• Agarosa con enlaces cruzado
• Poliacrilamida
• Las moléculas grandes fluyen más rápido que las
  pequeñas.

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Desarrollo de una cromatografía de exclusión
molecular

• Determinación del tamaño de la columna
• Hidratación y lavado de la resina
• Empaque de la columna
• Determinación del volumen vacío
• Corrimiento de la muestra

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Cromatograma de exclusión molecular (EM)
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Elusión de una columna de cromatografía de EM
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Cromatografía de exclusión
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Características de las resinas de EM clásicas
Rango de Fraccionamiento (kDa)
Flujo máximo (cm/hr)
Nombre
Código
BioGel Sephadex
P-60 P-100 P-200 P-300 G-50 G-100 G-150 G-200
3-60 5-100 30-200 60-300 2-30 4-150 5-300 5-600
5 5 4 3 5 5 3 2
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Intercambio iónico
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Intercambio iónico

• Las proteínas difieren mucho en su afinidad por
  materiales cargados positiva o negativamente.
• Los soportes pueden ser
• Dextrán con enlaces cruzados
• Agarosa con enlaces cruzado
• Poliacrilamida
• Celulosa
• Poliestireno
• Sílice

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Grupos intercambiadores

• Fosfato (P)

PO3-

• Carboximetilo (CM)

CH2 COO-

• Dietilaminoetil (DEAE)

2

• Mono Q

CH2 N
(CH3)3
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Principios del intercambio iónico

• La afinidad de una proteína es proporcional a la
  concentración de sal requerida para liberarla del
  material.
• Una columna se carga (de proteínas) con un
  amortiguador de baja fuerza iónica y la elusión
  se inicia por incremento de la concentración del
  amortiguador de elusión.

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Desarrollo de una cromatografía de intercambio
iónico

• Hidratación y Lavado de la resina
• Activación (lavado con ácido y base fuerte
  diluidos, HCl 1M seguido de NaOH 1M y finalmente
  con la sal que se usará ej. NaCl 1M y equilibrar
  con buffer sin sal)
• Volumen de la columna y capacidad de retención de
  la resina.

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Diferentes sales tienen diferentes fuerzas de
elución cuando se usan en cromatografía de
intercambio iónico.

• Intercambio del anión
• citratogtsulfatogtoxalatogtI-gtNO3-2gtCrO4-gtBr- gt SCN-
  gt Cl- gt Formiato
• Intercambio del catión
• Ba2 gt Pb2 gt Sr2 gt Ca2 gt Ni2 gt Cd gt Cu gt Co gt
  ZngtMggtTigt Ag gt RbgtCsgtKgtNH4gtNagtHgtLi

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Amortiguadores

• Para intercambiadores aniónicos se deben usar
  amortiguadores catiónicos o zwitterionicos
• No usar amortiguadores aniónicos pues se unen a
  la resina.
• Usar detergentes catiónicos o no iónicos.

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Cromatograma de intercambio iónico
b
53
500
NaCl mM
280 nm
0
A
30
90
60
0
Tiempo de retención (min)
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Hidroxiapatita (HA)

• Introducida por Tiselius et al. en 1956
• Bernardi realizó un estudio sistemático (Meth. In
  Enzimol. Vol. 22 y 27)

Tiselius A et al., (1956) Protein chromatography
on calcium phosphate columns, Arch Biochem
Biophys 65, 132155
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Fórmula

• Forma cristalizada de fosfato de calcio
• (Ca10(PO4)6(OH)2)

Kawasaki T et al., (1985) Hydroxyapatite
high-performance liquid chromatography column
performance for proteins, Eur J Biochem 152,
361371
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Unión selectiva de proteínas a la hidroxiapatita

• A, es una proteína básica.
• B, es una proteína acídica
• El triángulo indica enlaces de coordinación.
• Los dobles paréntesis indican repulsión.
• Las líneas punteadas indican enlaces iónicos.

Los grupos amino son atraídos por los sitios
fosfato pero repelidos por los sitios carboxilo.
Esto es al contrario para los carboxilos.
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Adsorción de grupos amino

• Se debe a interacción electrostática no
  específica entre su cargas positivas y las cargas
  generales negativas de la columna de HA cuando la
  columna es equilibrada con amortiguador de
  fosfato.

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Incremento de la unión de aminas por bloqueo de
la repulsión.

• A, es una proteína básica.
• B, es una proteína acídica
• El triángulo indica enlaces de coordinación.
• Los dobles paréntesis indican repulsión.
• Las líneas punteadas indican enlaces iónicos.

Los grupos fosfatos en solución pueden cubrir a
calcios que repelerían a los grupos aminos.
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Disociación selectiva de la hidroxiapatita

• A, es una proteína básica.
• B, es una proteína acídica
• El triángulo indica enlaces de coordinación.
  Notar que estos no se afectan.

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Efecto de la concentración de fosfato en la unión
de proteínas

• El perfil superior fue cargado con fosfato 1 mM
• El inferior, con fosfato 50 mM.
• La capacidad de unión de las IgG se mejoró
  reduciendo la competencia de contaminantes.

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Barrido con dos gradientes

• El primer gradiente va de 0 a 500 mM de cloruro
  de sodio.
• El segundo, de 0 a 500 mM de fosfato de potasio.
• El amortiguador base es 0.5 M MES, 1mM fosfato,
  pH 6.
• La elusión de la IgG se observa en gris

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Usos

• Purificación de
• Proteínas
• Ácidos nucléicos
• Virus

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Bases de la Técnica

• Su selectividad no depende de la masa molecular,
  densidad de carga o punto isoeléctrico.

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Bases de la técnica

• La adsorción y la elución de las proteínas no son
  procesos en reversa de un solo efecto.
• Los grupos amino y carboxilo actúan de manera
  diferente en la adsorción de las proteínas a la
  HA.
• La elución de proteínas ácidas y básicas por
  diferentes sales tiene deferentes mecanismos.

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Ventajas

• HA tiene poco poder de adsorción de moléculas de
  masa molecular baja como nucleótidos, sales y
  aminoácidos.
• Es relativamente incompresible.
• Existen variantes cerámicas más fáciles de
  trabajar pues no se compactan.

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Cromatografía hidrofóbica
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Cromatografía Hidrofóbica

• Los grupos adicionados al soporte son el alcohol
  octílico, grupos bencénicos u otros grupos
  hidrófobos como hidrocarburos (C4, C8 o C18).
• Los centros hidrófobos de las proteínas son
  expuestos por exceso de salinidad y son atrapados
  por la columna.

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Cromatograma hidrofóbico
b
53
500
(NH4)2SO4 mM
280 nm
A
0
30
90
60
0
Tiempo de retención (min)
40
Series caotrópicas

• Aniones
• PO4gtSO4gtCH3COOgtCLgtBrgtNO3gtClO4gtIgtSCN
• Cationes
• NH4gtRbgtKgtNagtCsgtLigtMggtCa2gtBa2

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Cromatografía de Afinidad

• Sistema muy poderoso de purificación
• Sistema restringido
• Se basa en la interacción específica de dos
  compuestos
• Antígeno - Anticuerpo
• Enzima - sustrato
• Receptor - Ligando

42
(No Transcript)
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HPLC

• Cromatografía líquida de alta resolución
• High-performance liquid chromatography

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Limitaciones de la cromatografía a bajas presiones

• Imposibilidad física de aumentar el flujo
• Resinas compresibles
• Corridas de muchas horas
• Grandes volúmenes

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Descubrimientos que facilitaron la HPLC

• Síntesis de resinas incompresibles
• Nuevas técnicas en el empaque de las columnas
• Microparticulación de las resinas
• Adelantos en la tecnología espectrofotometrica

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Tipos de HPLC

• De exclusión molecular
• Intercambio iónico
• Hidrofóbica
• Afinidad
• De fase reversa

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Instrumentación

• Sistema de bombeo
• Resistente a químicos
• Poca variabilidad
• Presiones de 30 as 400 atm
• Flujo constante (libre de pulsos)
• Buen mezclado de los solventes
• Reproducibilidad en la formación de los gradientes

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Tipos de bombas

• Jeringa
• Pistón recíproco
• Diafragma
• Presión constante

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Detectores

• Detectores de UV-Visible que pueda leer 2 o más
  longitudes de onda al mismo tiempo
• Detector de arreglo de diodos. Espectro de 200 a
  600 nm en menos de 1 segundo.

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Cromatografía de fase reversa

• Se basa en las propiedades hidrofóbicas de las
  proteínas.
• El proceso de elución es diferente que en la
  cromatografía hidrofóbica
• La fase móvil es un solvente orgánico (metanol,
  2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA,
  ácido fosfórico, acético o hidroxibutírico).

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Fase estacionaria

• Sílica acoplada con un derivado alquilsilano.
• La longitud de la cadena alquilo puede ser de C4,
  C8, C18.
• La porosidad del soporte es variable y se
  recomienda que sea entre 300 a 1000 A
• El tamaño de las partículas es de 5 a 20 µm

o
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Fase móvil

• La acidez de la fase móvil
• Influencia el estado iónico de la proteína
• Controla la ionización de la superficie silanol
• Forma pares iónicos con la zona catiónica de la
  proteína
• Favorece la exposición de zonas hidrofóbicas de
  la proteína

53
Cromatograma de fase reversa
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HPLC de Fase Reversa

• Separación eficiente aún con concentraciones
  altas de proteínas
• Bajo ruido de fondo
• Solventes volátiles
• Fácil formulación de la fase móvil
• Reproducibilidad de gradientes.

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Diagrama del sistema HPLC
Termostato de la columna
Celda Microbore
Celda Analítica
Columna
Celda Preparativa
56
HPLC WATERS modelo antiguo
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HPLC WATERS
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(No Transcript)
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(No Transcript)
60
(No Transcript)
61
(No Transcript)
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Cromatógrafo de Gases
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Principales componentes

• Gas de acarreo
• Controladores de flujo
• Inyectores
• Columnas
• Detectores
• Sistema de datos

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Gas de acarreo

• Con ciertos tipos de columnas y detectores, se
  requiere el uso de un gas de complemento en el
  detector (make-up).
• El make-up, es un gas de arrastre adicionado al
  efluente de la columna antes de que pase al
  detector.
• El sistema del gas portador, por lo general
  contiene uno o varios tamices con el objeto de
  eliminar humedad, hidrocarburos y oxígeno.
• Los caudales utilizados en las columnas empacadas
  oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en
  las capilares.