Prote

1
Proteínas

• Predição de Estrutura Secundária
• Marcilio Souto
• DIMAp/UFRN

2
Somos seres protéicos

• A vida está intimamente ligada às proteínas
• Estas moléculas especiais realizam as mais
  variadas funções no nosso organismo
• Transporte de nutrientes e metabólitos, catálise
  de reações biológicas
• Apesar da complexidade de suas funções, as
  proteínas são relativamente simples
• Repetições de 20 unidades básicas, os aminoácidos

3
Aminoácido

• Um aminoácido consiste em um caborno central
  com uma ligação a grupo amino (-NH2), outra a um
  grupo carboxila (-COOH), a terceira a um átomo de
  hidrogênio e a quarta a uma cadeia lateral
  variável

COO- H3N--C--H
R
4
Aminoácidos

• Single- three-letter amino acid codes
• G Glycine Gly P Proline Pro
• A Alanine Ala V Valine Val
• L Leucine Leu I Isoleucine Ile
• M Methionine Met C Cysteine Cys
• F Phenylalanine Phe Y Tyrosine Tyr
• W Tryptophan Trp H Histidine His
• K Lysine Lys R Arginine Arg
• Q Glutamine Gln N Asparagine Asn
• E Glutamic Acid Glu D Aspartic Acid Asp
• S Serine Ser T Threonine Thr
• Additional codes
• B Asn/Asp Z Gln/Glu X Any amino acid

5
Definição

• As proteínas são macromoléculas complexas,
  compostas de aminoácidos, e necessárias para os
  processos químicos que ocorrem nos organismos
  vivos
• São os constituintes básicos da vida tanto que
  seu nome deriva da palavra grega "proteios", que
  significa "em primeiro lugar
• Nos animais, as proteínas correspondem a cerca de
  80 do peso dos músculos desidratados, cerca de
  70 da pele e 90 do sangue seco. Mesmo nos
  vegetais as proteínas estão presentes.

6
Importância

• A importância das proteínas, entretanto, está
  relacionada com suas funções no organismo, e não
  com sua quantidade
• Todas as enzimas conhecidas, por exemplo, são
  proteínas
• Muitas vezes, as enzimas existem em porções muito
  pequenas.
• Mesmo assim, estas substâncias catalisam todas as
  reações metabólicas e capacitam aos organismos a
  construção de outras moléculas - proteínas,
  ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios - que
  são necessárias para a vida.

7
Polipeptídeos

• As proteínas também são chamadas de
  polipeptídeos, porque os aminoácidos que as
  compõe são unidos por ligações peptídicas
• Uma ligação peptídica é a união do grupo amino
  (-NH2) de um aminoácido com o grupo carboxila
  (-COOH) de outro aminoácido, através da formação
  de uma amida

8
Estrutura da Proteínas

• Embora sejam quase inúmeras, todas as proteínas
  são formadas exclusivamente por apenas 20
  aminoácidos, que se repetem numa seqüência
  característica para cada proteína
• Esta seqüência, conhecida como estrutura
  primária, é que, de fato, determina a forma e a
  função da proteína.
• A estrutura primária é somente a sequência dos
  amino ácidos, sem se preocupar com a orientação
  espacial da molécula
• As interações intermoleculares entre os
  aminoácidos das proteínas fazem com que a cadeia
  protéica assuma uma estrutura secundária e uma
  estrutura terciária.

9
Estrutura Secundária

• A estrutura secundária é uma função dos ângulos
  formados pelas ligações peptídicas que ligam os
  aminoácidos
• "The secondary structure of a segment of
  polypeptide chain is the local spatial
  arrangement of its main-chain atoms without
  regard to the conformation of its side chains or
  to its relationship with other segments".
• A conformação espacial é mantida graças as
  interações intermoleculares (ligação hidrogênio)
  entre os hidrogênios dos grupos amino e os átomos
  de oxigênio dos outros amino ácidos.

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Estrutura Secundária

• Em geral, estas ligações forçam a proteína a
  assumir uma forma helicoidal, como uma corda
  enrolada em torno de um tubo imaginário.
• Esta forma, a mais comum, é chamado de alfa
  hélice.
• Outras duas formas na estrutura secundária são as
  beta-sheets e turns. Nas beta-sheets, um segmento
  da cadeia interage com outro, paralelamente.

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?-Hélice

• É a forma mais comum de estrutura secundária
  regular
• Caracteriza-se por uma hélice em espiral formada
  por 3,6 resíduos de aminoácidos por volta
• As cadeias laterais dos aminoácidos se distribuem
  para fora da hélice
• A principal força de estabilização da a - Hélice
  é a ponte de hidrogênio.

12
?-Folhas

• Envolve 2 ou mais segmentos polipeptídicos da
  mesma molécula ou de moléculas diferentes,
  arranjados em paralelo ou no sentido
  anti-paralelo
• Os segmentos em folha ? da proteína adquirem um
  aspecto de uma folha de papel dobrada em pregas.
• As pontes de hidrogênio mais uma vez são a força
  de estabilização principal desta estrutura

13
Estrutura Terciária

• A estrutura terciária relaciona-se com os
  loopings e dobraduras da cadeia protéica sobre
  ela mesma.
• É a conformação espacial da proteína, como um
  todo, e não de determinados segmentos
  particulares da cadeia protéica.
• A forma das proteínas está relacionada com sua
  estrutura terciária.
• Existem, por exemplo, proteínas globulares (que
  tem forma esférica).

14
Estrutura Terciária

• O que determina a estrutura terciária são as
  cadeias laterais dos aminoácidos
• Algumas cadeias são tão longas e hidrofóbicas que
  perturbam a estrutura secundária helicoidal,
  provocando a dobra ou looping da proteína.
• Muitas vezes, as partes hidrofóbicas da proteína
  agrupam-se no interior da proteína dobrada
• Longe da água e dos íons do ambiente onde a
  proteína se encontra, deixando as partes
  hidrofílicas expostas na superfície da estrutura
  da proteína.
• Regiões como "sítio ativos", "sítios
  regulatórios" e módulos são propriedades da
  estrutura terciária

15
Estrutura Terciária
16
Estrutura Quaternária

• Existe, finalmente, a estrutura quaternária
• Ccertas proteínas, tal como a hemoglobina, são
  compostas por mais de uma unidade polipeptídica
  (cadeia protéica).
• A conformação espacial destas cadeias, juntas, é
  que determina a estrutura quaternária. Esta
  estrutura é mantida pelas mesmas forças que
  determinam as estruturas secundárias e
  terciárias. A figura ao lado mostra uma
  imumoglobulina que é, na verdade, um tetrâmero,
  isto é, constituída por 4 cadeias protéicas
  (polipeptídeos).

17
Estrutura Quaternária

• A figura ao lado mostra uma imumoglobulina que é,
  na verdade, um tetrâmero, isto é, constituída por
  4 cadeias protéicas (polipeptídeos).

18
Proteínas Conjugadas

• As proteínas podem ser simples
• Constituidas somente por aminoácidos
• ou conjugadas
• Contêm grupos prostéticos, isto é, grupos não
  aminoácidos, tais como carbohidratos, íons,
  pigmentos, etc.
• A hemoglobina é um exemplo de proteína
  conjugada contém 4 grupos prostéticos, cada um
  consistindo de um íon de ferro e a porfirina. São
  justamente estes grupos que habilitam a
  hemoglobina a carregar o oxigênio através da
  corrente sanguínea. As liproproteínas, tal como
  LDL e HDL, são também exemplos de proteínas
  conjugadas - neste caso, com lipídeos.

19
Proteínas Conjugadas
20
Outras Classificações

• Uma outra forma de classificar as proteínas é
  baseado na sua função.
• Sobre este prisma, elas podem ser divididas em
  dois grupos
• proteínas estruturais e proteínas biologicamente
  ativas
• Algumas proteínas, entretanto, podem pertencer
  aos dois grupos
• A maioria das proteínas estruturais são fibrosas
  - compostas por cadeias alongadas. Dois bons
  exemplos, nos animais, são o colágeno (ossos,
  tendões, pele e ligamentos) e a queratina (unhas,
  cabelos, penas e bicos).

21
Outras Classificações

• A grande maioria das proteínas biologicamente
  ativas são globulares, e sua atividade funcional
  é intrínsica a sua organização espacial
• Exemplos são as enzimas, hormônios protéicos
  (que atuam como mensageiros químicos), proteínas
  de transporte (como as lipo-proteínas, que podem
  carregar o colesterol) e imunoglobulinas (ou
  anticorpos), que protegem o corpo de
  microorganimos invasores.
• Muitas proteínas biologicamente ativas ficam na
  região da membrana celular, e atuam de diversas
  maneiras

22
Outras Classificações

• A figura ao lado mostra uma porina, uma proteína
  trans-membrana, que atua como um canal iônico em
  bactérias. Existe um "buraco" na estrutura
  protéica, de cerca de 11 angstrons de diâmetro,
  onde os íons passam, seletivamente

23
Enzimas

• As enzimas são uma classe muito importante de
  proteínas biologicamente ativas.
• Elas são responsáveis pela catálise de diversas
  reações em nosso organismo. Reações que, sem o
  auxílio das enzimas, jamais aconteceriam ou,
  ainda, gerariam indesejados produtos colaterais.
• Em uma proteína enzimática, existe um certo
  domínio chamado de "sítio ativo", que liga-se ao
  substrato - a molécula reagente - e diminui a
  energia do estado de transição que leva ao
  produto desejado.
• A ligação entre o sítio ativo e o substrato é
  extremamente específica
• a molécula precisa ter certas características
  eletrônicas e espaciais que permitam o seu
  "encaixe" com a proteína. Por isso esta relação
  tem sido chamada de lock'n'key, ou seja,
  chave-fechadura.

24
Enzimas Sítio Ativo

• No exemplo da figura, uma determinada região da
  proteína liga-se à um substrato, que se adapta
  ao sítio ativo da enzima tal como uma chave faz a
  sua fechadura.

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Enzimas Inibidor

• A atividade de uma enzima pode ser bloqueada pela
  ação de outra molécula, um inibidor.
• Quando um inibidor interage com uma determinada
  região da enzima, chamado de sítio regulatório,
  provoca uma alteração na sua conformação e uma
  desativação do sítio catalítico.
• A atividade enzimática, portanto, pode ser
  controlada, pelo organismo, através da liberação
  ou captação de inibidores.

26
Enzimas Inibidor
27
Caso tenham esquecido

• A sequência dos amino ácidos em todas as
  proteínas - fator que é responsável por sua
  estrutura e função - é determinado geneticamente
  a partir da sequência dos nucleotídeos no DNA
  celular.
• Quando uma proteína em particular é necessária, o
  código do DNA (gene) para esta proteína é
  transcrito em uma sequência complementar de
  nucleotídeos ao longo de um segmento de RNA -
  chamado de RNA mensageiro.
• Este segmento de RNA serve como uma forma para a
  síntese da proteína subsequente cada grupo de 3
  nuclueotídeos especifica um determinado
  aminoácido
• estes aminoácidos são ligados na sequência
  codificada pelo RNA. No final do processo,
  obtém-se a proteína completa, cuja sequência de
  aminoácidos foi ditada pelo RNA mensageiro. Desta
  maneira, o organismo é capaz de sintetizar as
  várias proteínas com as funções mais diversas de
  que precisa.

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Previsão de Estrutura de Proteínas

• Experimental
• Cristalização
• Raios X
• Ressonância nuclear magnética
• Cerca de 10 a 12 mil estruturas em repositórios
  públicos
• Processo caro e demorado
• Teórico
• Homologia
• Ab Inition
• Threading
• Aprendizado de Máquina

29
Modelagem por Homologia

• A ferramenta mais bem sucedida de predição de
  estruturas tridimensionais de proteínas é a
  modelagem por homologia, também conhecida como
  modelagem comparativa.
• Esta abordagem baseia-se em alguns padrões
  gerais que têm sido observados, em nível
  molecular, no processo de evolução biológica
• homologia entre seqüências de aminoácidos implica
  em semelhança estrutural e funcional
• proteínas homólogas apresentam regiões internas
  conservadas (principalmente constituídas de
  elementos de estrutura secundária hélices-a e
  fitas-b)
• as principais diferenças estruturais entre
  proteínas homólogas ocorrem nas regiões externas,
  constituídas principalmente por alças ("loops"),
  que ligam os elementos de estruturas secundárias.

30
Modelagem por Homologia

• Outro fato importante é que as proteínas
  agrupam-se em um número limitado de famílias
  tridimensionais. Estima-se que existam cerca de
  5.000 famílias protéicas.
• Conseqüentemente, quando se conhece a estrutura
  de pelo menos um representante de uma família, é
  geralmente possível modelar, por homologia, os
  demais membros da família.

31
Modelagem por Homologia

• A modelagem de uma proteína (proteína-problema)
  pelo método da homologia baseia-se no conceito de
  evolução molecular.
• Isto é, parte-se do princípio de que a
  semelhança entre as estruturas primárias desta
  proteína e de proteínas homólogas de estruturas
  tridimensionais conhecidas (proteínas-molde)
  implica em similaridade estrutural entre elas.
• Os métodos correntes de modelagem de proteínas
  por homologia implicam basicamente em quatro
  passos sucessivos
• identificação e seleção de proteínas-molde
• alinhamento das seqüências de resíduos
• construção das coordenadas do modelo
• validação.

32
Threading

• Esta técnica é baseada na comparação da proteína
  em questão com modelos descritivos dos
  enovelamentos de proteínas homólogas
• Nesses modelos são descritas
• a distância entre os resíduos de aminoácidos
• a estrutura secundária de cada fragmento
• as características fisico-químicas de cada
  resíduo

33
Ab Initio

• Entretanto, um grande desejo dos que trabalham
  com proteínas é o desenvolvimento de programas
  realmente eficientes para a modelagem ab initio
• Um programa que seja capaz de predizer a
  estrutura terciária de uma proteína, tendo como
  informação apenas a seqüência dos resíduos de
  aminoácidos e suas interações fisico-químicas,
  entre si e com o meio.
• Programas assim existem hoje mas têm muito a
  melhorar para que possamos confiar unicamente no
  seu resultado.

34
Predição de Estrutura

• Decomposição em três problemas
• Da Estrutura Primária para a Estrutura Secundária
  e outras Características Estruturais
• Da Estrutura Primária e Características
  Estruturais para Representações Topológicas
• De Representações Topológicas para Coordenadas 3D.

35
Protein Structure Terms

• Protein Folds The core 3D structure of a domain
  is called a fold. There are only a few thousand
  possible folds.
• Motif A short conserved region in a protein
  sequence. Motifs are frequently highly conserved
  parts of domains.
• Domain An independently folded unit within a
  protein, often joined by a flexible segment of
  the polypeptide chain.
• Classused to classify protein domains according
  to their secondary structural content and
  organization
• Coreportion of the folded protein molecule that
  compromises the hydrophobic interior of the a
  helices and b sheets.
• Profilea scoring matrix that represents a
  multiple sequence alignment of a protein family

36
Protein Structure Terminology

• a helix the most abundant type of secondary
  structure in proteins. The helix has an average
  of 3.6 amino acids per turn with a hydrogen bond
  formed about every fourth residue. Average length
  is 10 amino acids
• b sheet- formed by hydrogen bonds between an
  average of 5-10 consecutive amino acids in one
  portion of the chain with another 5-10 further
  down the chain. The interacting regions may be
  adjacent, with a short loop in between or far
  apart with other structures in between.

37
Alpha Helix
38
(No Transcript)
39
Beta Sheet
40
(No Transcript)
41
(No Transcript)
42
Secondary Structure and Folding Classes

• In the absence of known information about
  secondary structure, there are methods available
  for predicting the ability of a sequence to form
  a helices and b strands.
• Methods rely on observations made from groups of
  proteins whose three-dimensional structure has
  been experimentally determined
• Classification system based on the order of
  secondary structural elements within a protein

43
Secondary Structure Prediction

• Predict the secondary structural conformation of
  each residue of protein sequences in general -
  making use of global rules applying across all
  sequence families (not those within individual
  families).
• Prediction programs are trained on data sets of
  non-homologous proteins of known structure (eg
  all sequence identity lt 25)

44
Estruturas Secundárias

• DSSP classes 
• H alpha helix
• E sheet
• G 3-10 helix
• S kind of turn
• T beta turn
• B beta bridge
• I pi-helix (very rare)
• C the rest
• CASP (harder) assignment 
• a H and G
• ß E and B
• ? the rest
• Alternative assignment 
• a H
• ß B
• ? the rest

45
Algorithms

• Nearest Neighbour - find the most similar
  sub-sequences of known structure (eg Levin,
  Robson, Garnier, 1986)
• Statistical, such as pairwise frequencies of
  amino acids as a function of separation and
  secondary structure (Garnier, Osguthorpe, Robson,
  1978)
• Neural Networks, (eg PHD - Rost and Sander, 1993)
  
• Hybrid methods, eg using statistics,
  physico-chemical properties such as hydrophobic
  moments and others (eg DSC, King and Sternberg,
  1996)

46
History

• The first generation prediction methods following
  in the 60's and 70's all based on single amino
  acid propensities
• The second-generation methods dominating the
  scene until the early 90's utilised propensities
  for segments of 3-51 adjacent residues
• It seemed that prediction accuracy stalled at
  levels slightly above 60
• The reason for this limit was the restriction to
  local information
• Can we introduce some global information into
  local stretches of residues

47
Traditional
48
(No Transcript)
49
Secondary structure prediction profits from
divergence

• Early on Dickerson 1976 realised that
  information contained in multiple alignments can
  improve predictions
• However, the breakthrough of the third generation
  methods to levels above 70 accuracy required a
  combination of larger databases with more
  advanced algorithms
• The major component of these new methods was the
  use of evolutionary information. All naturally
  evolved proteins with more than 35 pairwise
  identical residues over more than 100 aligned
  residues have similar structures

50
New database searches extend family divergence
found

• The breakthrough to large-scale routine searches
  has been achieved by the development of PSI-BLAST
  Altschul, S. et al. (1997) and Hidden Markov
  models Eddy, S. R. (1998) Karplus, K., Barrett,
  C. Hughey, R. (1998)
• More data refined search better prediction
• Prediction accuracy peaks at 76 accuracy. The
  currently best methods reach a level of 76
  three-state per-residue accuracy ( Table 1 ).
  This constitutes a sustained level more than four
  percentage points above last century's best
  method not using diverged profiles (PHD in Table
  1 )

51
(No Transcript)
52
(No Transcript)
53
Caution over-optimism

• Seemingly improve accuracy by ignoring short
  segments. There are many ways to publish higher
  levels of accuracy
• Comparing apples and oranges, or too few apples
  with one another
• There is NO value in comparing methods evaluated
  on different data sets
• For example, 16 new protein structures are
  clearly too few! For that set, JPred2, PHD, PROF,
  PSIPRED, SAM-T99sec and SSpro are
  indistinguishable
• Seemingly achieve 100 accuracy by using
  correlated sets
• EVA automatic evaluation of automatic prediction
  servers

54
Clever methods can be more accurate 1/4

• SSpro advanced recursive neural network system
• The only method published recently that appears
  to improve prediction accuracy significantly not
  through more divergent profiles but through the
  particular algorithm is SSpro Baldi, P., Brunak,
  S., Frasconi, P., Soda, G. Pollastri, G.
  (1999)
• The system never learns that secondary structure
  correlates between adjacent residues
• PHD addressed this problem by a second level
  structure-to-structure network that was trained
  on the predicted secondary structure from the
  first level sequence-to-structure network Rost,
  B. Sander, C. (1993). PSIPRED and JPred2 as
  well.
• Pierre Baldi and colleagues deviated
  substantially from this concept. Instead of using
  an additional network, they embedded the
  correlation into one single recursive neural
  network

55
Clever methods can be more accurate 2/4

• HMMSTR hidden Markov models for connecting
  library of structure fragments
• Can we predict secondary structure for protein U
  by local sequence similarity to segments of known
  structures S even when overall U differs from
  any of the known structures S?
• Yes, as shown by many nearest-neighbour-based
  prediction methods, the most successful of which
  seems to be NSSP Salamov, A. A. Solovyev, V.
  V. (1997)
• A conceptually quite different realisation of the
  same concept has been implemented in HMMSTR by
  Chris Bystroff, David Baker and colleagues (2000)
  

56
Clever methods can be more accurate 3/4

• HMMSTR hidden Markov models for connecting
  library of structure fragments
• Firstly, build a library of local stretches
  (3-19) of residues with 'basic structural motifs'
  (I-sites)
• Secondly, assemble these local motifs through
  Hidden Markov models introducing structural
  context on the level of super-secondary structure
• Thus, the goal is to predict protein structure
  through identification of 'grammatical units of
  protein structure formation
• Although HMMSTR intrinsically aims at predicting
  higher order aspects of 3D structure, a
  side-result is the prediction of 1D secondary
  structure

57
Clever methods can be more accurate 4/4

• Copenhagen a Danish group developed a neural
  network-based method that is most amazing in many
  respects Petersen, T. N. et al. (2000).
• The authors estimate the method to yield levels
  above 77 prediction accuracy
• If true, this is the best current method
• Like PSIPRED, JPred2, and PROF, the method uses
  PSI-BLAST profiles as input, and like most
  methods since PHD a two-level approach addressing
  the problem of predicting short segments
• It replaces the standard 3 output units (for
  helix, strand, other), by 9 output units
• Also new is the particular way of weighting the
  average over different networks by the overall
  reliability of the prediction for that network,
  and the mere number of different networks
  considered (up to 800!)

58
Combining mediocre and good methods is best

• Combination improves on non-systematic errors
• Systematic errors, e.g., through non-local
  effects
• White noise errors caused by, e.g., the
  succession of the examples during training neural
  networks
• Theoretically, combining any number of methods
  improves accuracy as long as the errors of the
  individual methods are mutually independent and
  are not only systematic
• PHD - and more recently others Chandonia,
  JPred2, Copenhagen - utilised this fact by
  combining different neural networks.

59
Discussion

• Methods improved significantly over last two
  years
• Growing databases and improved search techniques
  - predominantly through the iterated PSI-BLAST
  tool - yielded a substantial improvement in
  secondary structure prediction accuracy over the
  last two years.
• State-of-the-art methods now reach sustained
  levels of 76 prediction accuracy
• What is the limit of prediction accuracy?
• 88 is the limit, but shall we ever reach close
  to there?
• Larger databases may get us six percentage points
  higher, and it may not. The answer remains
  nebulous

60
References

• B. Rost (2001) Protein secondary structure
  prediction continues to rise. Journal of
  Structural Biology, 134, pp. 204-218 (Columbia
  University).
• Bystroff, C., Thorsson, V. Baker, D. (2000).
  HMMSTR a hidden Markov model for local
  sequence-structure correlations in proteins. J.
  Mol. Biol., 301, 173-190 (University of
  Washington)
• Cuff, J. A., Clamp, M. E., Siddiqui, A. S.,
  Finlay, M. Barton, G. J. (1998). JPred a
  consensus secondary structure prediction server.
  Bioinformatics, 14, 892-893 (JPred
  Oxford/Cambridge)
• Cuff, J. A. Barton, G. J. (2000). Application
  of multiple sequence alignment profiles to
  improve protein secondary structure prediction.
  Proteins, 40, 502-511 (JPred2)
• Rost, B. (1996). PHD predicting one-dimensional
  protein structure by profile based neural
  networks. Meth. Enzymol., 266, 525-539. (PHD
  Heidelberg Germany)

61
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  structure prediction plug-in and win. Columbia
  University (PHDPsi)
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  prediction through more data. Columbia
  University, WWW document (http//cubic.bioc.columb
  ia.edu/predictprotein) (PROF)
• Altschul, S., Madden, T., Shaffer, A., Zhang, J.,
  Zhang, Z. et al. (1997). Gapped Blast and
  PSI-Blast a new generation of protein database
  search programs. Nucl. Acids Res., 25, 3389-3402.
  (PSI-BLAST USA)
• Jones, D. T. (1999). Protein secondary structure
  prediction based on position-specific scoring
  matrices. J. Mol. Biol., 292, 195-202 (PSIPRED
  Warwick)
• Karplus, K., Barrett, C. Hughey, R. (1998).
  Hidden Markov models for detecting remote protein
  homologies. Bioinformatics, 14, 846-856
  (SAM-T99Sec University of California Sta. Cruz)

62
References

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  Pollastri, G. (1999). Exploiting the past and the
  future in protein secondary structure prediction.
  Bioinformatics, 15, 937-946. (Sspro University
  of California at Irvine and Italy)
• Petersen, T. N., Lundegaard, C., Nielsen, M.,
  Bohr, H., Bohr, J. et al. (2000). Prediction of
  protein secondary structure at 80 accuracy.
  Proteins, 41, 17-20 Denamark, including Brunak)
• Salamov, A. A. Solovyev, V. V. (1997). Protein
  secondary structure prediction using local
  alignments. J. Mol. Biol., 268, 31-36
  (nearest-neigbour method)