La regolazione dell

1
La regolazione dellespressione genica
Tutte le cellule di un organismo multicellulare
possiedono tutti i geni della propria specie
tuttavia solo una piccolissima frazione è attiva
in ogni cellula per esempio, in una cellula
delle isole del pancreas è attivo il gene per
linsulina, non quelli per lemoglobina (attivi
nelle cellule dei midollo osseo, progenitrici dei
globuli rossi) o per la pepsina (attivi nelle
cellule della mucosa gastrica)
Durante lo sviluppo embrionale di un organismo
multicellulare, le cellule destinate a costituire
i diversi tessuti e organi attivano in momenti
precisi i geni che codificano le proteine che
stimolano o inibiscono la proliferazione
cellulare e quelle caratteristiche del tessuto in
formazione (per esempio osseina per le ossa,
cheratina per la pelle)
Anche gli organismi unicellulari hanno bisogno di
attivare alcuni geni solo in particolari
circostanze (per esempio la presenza di un
nutrimento che richiede particolari enzimi) per
non sprecare lenergia e le molecole necessarie
Le cellule tumorali hanno perduto, anche in
seguito a mutazioni somatiche, la capacità di
regolare lespressione genica relativa alle
proteine che controllano la proliferazione
cellulare
Dunque nelle prossimità dei geni ci devono essere
recettori in grado di percepire segnali
provenienti dallambiente esterno e veicolati
allinterno della cellula tali recettori devono
quindi segnalare ai geni se trascrivere o no, in
funzione dei segnali provenienti dallesterno
2
Il sistema lac in E. coli
Lattosio
H2O
Lenzima b-galattosidasi, che consente di
utilizzare il lattosio come fonte di carbonio e
di energia, viene sintetizzato in presenza di
lattosio che quindi oltre che esserne il
substrato è anche linduttore della sua sintesi
b-galattosidasi
Dal lattosio è indotta la sintesi di altri 2
enzimi permeasi e transacetilasi anche la
permeasi è coinvolta nel metabolismo del
lattosio, poiché facilita lingresso del lattosio
nella cellula.
Glucosio
Galattosio
3
I geni strutturali e il gene I
I allele normaleZ, Y, A trascrivono in
presenza dellinduttore I- mutante
costitutivo Z, Y, A trascrivono sempre Is
allele inibente la risposta allinduttore Z, Y,
A non trascrivono mai
I
Z
Y
A
trascrizione
Merodiploidi per definire le relazioni funzionali
tra gli alleli
Un unico mRNA policistronico
IZ-/I-Z Trascrive con linduttore
I-Z-/IZ Trascrive con linduttore
I-Z-/I-Z Trascrive sempre
IsZ/IZ Non trascrive mai
IsZ/I-Z Non trascrive mai
traduzione
transacetilasi
b-galattosidasi
F(lac)
permeasi
Geni lac
1) Is è dominante su I che a sua volta è
dominante su I-
un mRNA per un enzima funzionale
2) I è dominante su I- indipendentemente dalla
posizione in cis o in trans rispetto a Z
4
Operatore, promotore e operone
I
Z
Y
A
O
P
operone
O allele normaleZ, Y, A trascrivono in
presenza dellinduttore Oc mutante
costitutivo Z, Y, A trascrivono sempre
OZ/OcZ Trascrive sempre
OZ/OcZ- Trascrive con linduttore
OZ-/OcZ Trascrive sempre
IsOZ/IOcZ Trascrive sempre
Il prodotto del gene I è una proteina diffusibile
che, in assenza dellinduttore, si lega ad O e
impedisce la trascrizione di Z, Y , A in
presenza dellinduttore non si lega ad O e
consente la trascrizione di Z, Y, A
un mRNA per un enzima funzionale
1) Oc è dominante su O, ma solo in cis rispetto
a Z (cis-dominanza)
2) Gli alleli normali di P sono cis-dominanti sui
mutanti difettivi di P, che impediscono
incondizionatamente la trascrizione di Z, Y, A,
impedendo linserimento della RNA polimerasi
5
Controllo negativo dellespressione genica
nelloperone lac
repressore non legato allinduttore, che si lega
ad O e impedisce la trascrizione
RNA polimerasi
Z
Y
A
O
P
I
repressore legato allinduttore, che non
si lega ad O e non impedisce la trascrizione
mRNA
Z
Y
A
O
P
I
I-
repressore I- senza affinità per O, con cui non
si lega mai e non impedisce mai la trascrizione
repressore Is senza affinità per linduttore, che
si lega sempre ad O e impedisce sempre la
trascrizione
Z
Y
A
O
P
I
Is
operatore senza affinità per il repressore che
non lega mai e non impedisce mai la trascrizione
Z
Y
A
O
P
I
Oc
Z
Y
A
O
P
I
promotore senza affinità per lRNA polimerasi che
impedisce sempre la trascrizione
P-
6
Controllo positivo dellespressione genica
nelloperone lac
A basse concentrazioni di glucosio aumenta la
concentrazione di AMP ciclico (cAMP).
cAMP si lega a una proteina attivatrice (CAP).
Z
Y
A
O
P
mRNA
RNA polimerasi
cAMP
e, in presenza di lattosio, che blocca il
repressore,
Il complesso CAP-cAMP si lega al promotore e ne
aumenta laffinità per lRNA polimerasi
CAP
intensifica la trascrizione di Z, Y ed A.
Controllo negativo dellespressione genica
nelloperone trp
repressore non legato al triptofano, che non si
lega ad O e consente la trascrizione
trpE
trpD
trpC
O
P
trpB
trpA
triptofano
mRNA
RNA polimerasi
repressore legato al triptofano, che si lega ad O
e non consente la trascrizione
7
Organizzazione della cromatina e controllo della
trascrizione negli eucarioti
Lacetilazione degli istoni, mediata dalle
proteine attivatrici e da trans-acetilasi,
allenta il legame con il DNA, che diventa
accessibile ai fattori di trascrizione e alla RNA
polimerasi
Nei nuclei in interfase i cromosomi hanno domini
separati, che si possono vedere con sonde
specifiche
Le regioni che devono trascrivere si spostano
alla superficie dei domini
attivatore
transacetilasi
deacetilasi
La metilazione degli istoni compatta la cromatina
e rende il DNA inaccessibile
acetile
Terminata la trascrizione, gli istoni sono
deacetilati con lazione di una deacetilasi e si
ripristina il legame DNA-istoni nei nucleosomi,
tornando alle condizioni di riposo.
metile
8
Regolazione della trascrizione negli eucarioti
promotore e intensificatori
Regioni regolatrici dei geni eucariotici
Regioni
Sequenze,
Funzioni
Posizioni
Regione centrale del promotore
TATA box
Legame con fattori di trascrizione, RNA
polimerasi II
25-30 nucleotidi a monte
Promotore (altre regioni)
CAAT box e/o GC box
Legame con fattori di trascrizione (generali e
specifici)
Distanze varie, a monte
Intensificatori
Varie
Legame con proteine attivatrici, modificazione
della cromatina
Varia
Attivatori
Complesso di fattori di trascrizione
RNA polimerasi II
CAAT box
TATA box
Intensificatore
9
Inattivazione a lungo termine della trascrizione
negli eucarioti eterocromatina costitutiva e
facoltativa
Le regioni cromosomiche con la cromatina compatta
sono visibili nei nuclei in interfase come zolle
più colorate e costituiscono leterocromatina
Il compattamento avviene con lavvolgimento dei
nucleosomi a formare il solenoide
e con il ripiegamento della cromatina sulla
matrice.
Le regioni con DNA satellite non hanno geni, non
trascrivono mai e sono sempre compatte
(eterocromatina costitutiva)
Il cromosoma X inattivo rimane condensato in
interfase (eterocromatina facoltativa), ove è
visibile come corpo di Barr.
La metilazione della citosina nel DNA in sequenze
5CG3 è connessa con linattivazione del
cromosoma X
Durante le fasi precoci dellembriogenesi uno dei
2 cromosomi X di femmine di mammifero è
inattivato a caso in ciascuna cellula somatica e
linattivazione è ereditata dalla discendenza
cellulare i tessuti somatici femminili sono
mosaici clonali epigenetici, cioè despressione
genica.
10
Inattivazione a lungo termine della trascrizione
negli eucarioti limprinting genomico
Durante la gametogenesi sono inattivati alcuni
geni specifici, che sono diversi nelle cellule
germinali maschili e femminili (imprinting
genomico).
Disomia uniparentale
geni inattivati nei gameti maschili
geni inattivati nei gametifemminili
Nelle fasi precoci dello sviluppo embrionale
linattivazione viene rimossa nella linea
germinale
La metilazione della citosina nel DNA in sequenze
5CG3 è connessa con limprinting genomico
Zigote bilanciato geneticamente (tutti i geni in
2 copie) ed epigeneticamente (almeno una copia
attiva di tutti i geni).
Zigote bilanciato geneticamente (tutti i geni in
2 copie) ma sbilanciato epigeneticamente (almeno
ungene non ha una copia attiva).
La metilazione della citosina nel DNA in sequenze
5CG3 è connessa infine con linattivazione di
geni ad azine tessuto-specifica
11
Il controllo dopo la trascrizione negli eucarioti
Controllo quantitativo linterferenza da RNA
Complesso RISC
Complesso DICER
siRNA
1) Un breve (70 nucleotidi) RNA a doppio
filamento viene tagliato da DICER
mRNA
trascrizione
2) Un dei 2 filamenti complementari residui (21
nucleotidi), detto siRNA, si lega a RISC
3) siRNA-RISC si appaia a una regione
complementare di uno specifico mRNA e lo frammenta
4) I frammenti dellmRNA sono degradati
miRNA
mRNA
1) Un breve (70-130 nucleotidi) RNA a forcina
viene tagliato da DICER
3) Un dei 2 filamenti complementari residui
(19-24 nucleotidi), detto miRNA, si appaia a una
regione complementare allestremità 3 non
tradotta di uno specifico mRNA e ne blocca la
traduzione
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Il controllo della traduzione negli eucarioti
b-tubulina
.
.
In assenza/bassa concentrazione di b-tubulina, la
traduzione dellmRNA della b-tubulina procede
fino al completamento e il rilascio del
polipeptide.
b-tubulina
.
.
RNasi
In presenza di concentrazioni alte di b-tubulina,
la traduzione dellmRNA della b-tubulina è
bloccata dal legame che si crea tra alcuni
aminoacidi centrali della b-tubulina già presente
nel citoplasma con i primi 4 aminoacidi della
b-tubulina nascente tale complesso induce
lazione di una Rnasi che taglia e degrada lmRNA
legato al ribosoma.
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Un gene più catene polipeptidiche?
editing dellmRNA
mRNA
Cambiamenti nella sequenza degli mRNA possono
avvenire per inserzione/delezione di base (p. es
mRNA mitocondrali)
UUUU
mRNA
Cambiamenti nella sequenza degli mRNA possono
avvenire per isostituzione di base (p. es mRNA
dellapolipoproteina B nellintestino umano)
AA
C
U
splicing alternativo
Esoni costitutivi
pre-mRNA
Esoni facoltativi
Introni
mRNA alternativi
Al gene SLO nelluomo sono attribuiti 500
possibili mRNA nelle cellule della coclea
Al gene Dscam in Drosophila sono attribuiti più
di 30.000 possibili mRNA nei neuroni
14
Splicing alternativo determinazione del sesso in
Drosophila
Sxl
Tra
pre-mRNA
Polipetide tradotto
Dsx
pre-mRNA
Polipetide tradotto
Differenziamento maschile
Differenziamento femminile
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Ingegneria genetica
Le tecniche dellingegneria genetica permettono
di isolare un gene che codifica per una
determinata proteina e di inserirlo, mediante dei
vettori adatti, nel genoma di un altro
organismo. Queste tecniche sono state applicate
al campo della medicina per la produzione
farmaci, per la diagnosi di malattie genetiche,
per la progettazione di vaccini. In agricoltura
si stanno progettando piante e animali
transgenici, per aumentarne la produttività e
migliorarne la qualità.



Ma tutto ciò pone problemi nuovi di
carattere etico, economico, biologico che devono
essere attentamente valutati per la tutela della
vita e dellambiente.
DNA ricombinante (plasmide)
Batterio ricombinante
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Enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi
capaci di tagliare il DNA producendo rotture a
doppia elica in corrispondenza di sequenze
specifiche di nucleotidi (siti di restrizione)
di essi si servono i batteri per distruggere i
cromosomi virali

• Un taglio è detto adesivo quando
• È sfalsato, o sono aggiunti nucleotidi al 3
• I nucleotidi a singolo filamento, sfalsati o
  aggiunti, sono fra loro complementari

Tipo di taglio
endonucleasi
Sito di restrizione
G
AATTC
Sfalsato, adesivo
53
EcoRI
CTTAA
G
CC
GG
Tronco, non adesivo
53
HaeIII
CC
GG
Le estremità di un taglio adesivo si possono
unire mediante i legami idrogeno tra le basi
complementari presenti a singolo filamento sui 2
segmenti di DNA successivamente, mediante
lazione di ligasi e, se serve, di DNA
polimerasi, si saldano i filamenti
polinucleotidici (vedere diapositiva 8)
Formazione di code
CC
GG
AA
53
GG
CC
TT
Si possono aggiungere al 3 di uno dei 2
filamenti di un capo di un taglio tronco, non
adesivo, una breve sequenza, ripetizione di un
solo nucleotide e al 3 dellaltro capo la
sequenza complementare, rendendo adesivo il taglio
I siti di restrizione sono brevi sequenze
palindromiche la sequenza posta a un lato
rispetto al centro del sito è complementare alla
sequenza inversa rispetto a quella posta al lato
opposto
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Mappe di restrizione
Una mappa di restrizione consiste
nellidentificazione della successione dei siti
di restrizione per diverse endonucleasi in un
segmento di DNA, misurando la distanza tra i siti
come numero di nucleotidi
1) Si esamina un frammento di DNA, marcandolo con
32P al 5
2) Si digerisce il frammento con diversi enzimi
di restrizione
3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo
spazio percorso su un gel mediante elettroforesi
Lelettroforesi consiste nel collocare le
macromolecole in un pozzetto allestremità di un
gel (gelatina) che viene poi sottoposto un campo
elettrico le molecole si spostano con una
velocità proporzionale alla propria carica
elettrica e inversamente proporzionale lla
propria lunghezza poiché nel DNA la carica è
distribuita uniformemente, la velocità dipende
solo dalla lunghezza del frammento
18
Il DNA ricombinante
DNA da clonare
vettore
VETTORI
Sono cromosomi capaci di replicare e
selezionabili, in cui si possono inserire
segmenti di DNA di interesse
Digestione con endonucleasi
DNA polimerasi I ligasi
I vettori possono essere
-plasmidi,
-cromosomi di fagil,
-ibridi fago-plasmide (cosmidi),
tutti capaci di replicarsi in E. coli,
-YAC, cioè
cromosomi artificiali di lievito, capaci di
replicarsi in lievito In ogni tipo di vettore si
può inserire un frammento di DNA di una
particolare lunghezza massima
Estremità adesive spontanee o costruite, fra loro
uguali
Estremità adesive complementari alle precedenti
19
La clonazione del DNA
Individuazione dei geni clonati Southern blotting
Clonazione non selettiva
P 1-(1-f)N
Clonazione selettiva
Genoma da saggiare frammentato con enzimi di
restrizione
Libridazione cn la sonda radioattiva si effettua
direttamente sui frammenti del genoma,
identificando così il frammento da saggiare
Cromosomi di l frammentati
1) Si effettua lelettroforesi su gel dei
frammenti a doppia elica
ligasi
Genoteca di DNA ricombinante
2) Si denatura il DNA e lo si fa aderire a
singolo filamento, nelle stesse posizioni, a un
filtro
Clonazione
3) Si ibridizza con sonda radioattiva
complementare al frammento cercato e si effettua
lautoradiografia, localizzando così il gene
studiato
Ibridazione su filtro con sonda radioattiva
complementare al DNA da studiare
20
C-DNA, walking cromosomico e sequenziamento
cDNA
WALKING CROMOSOMICO
RNA
Mediante piccole sonde, in comune a più frammenti
è possibile mettere questi ultimi in sequenza
AAAAA
TTT
Trascrittasi inversa
primer
DNA polimerasi
IL cDNA CONSENTE DI STUDIARE GLI mRNA E
CONFRONTARLI CON I GENI O I TRASCRITTI PRIMARI
SEQUENZIAMENTO DEI NUCLEOTIDI
1) Si marca con 32P lestremità 5 del frammento
da analizzare, quindi si denatura il DNA
G
GA
C
CT
2) Si distruggono selettivamente basi o loro
combinazioni (G, GA, C, CT), che rendono più
fragile il filamento saggiato, che quindi si
rompe in quei punti
G
C
A
3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo
spazio percorsoin una corsa elettroforetica
T
21
Reazione a catena della polimerasi (PCR)
PCR
Taq polimerasi, resistente al caldo
Primer 1
Regione complementare a
Primer 2
Regione complementare a
Si alternano cicli di denaturazione (a
temperatura alta) e di replicazione ( a
temperatura bassa), ciascuno dei quali porta un
raddoppiamento del numero delle molecole
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Costruire nuovi geni
SINTESI DI SEQUENZE NON SU STAMPO è possibile
allungare filamenti di DNA al 5 aggiungendo
nucleotide dopo nucleotide costruendo
oligonucleotidi di sequenza voluta
INDUZIONE DI MUTAZIONI SPECIFICHE
3) Si modificano specifici nucleotidi sul
filamento rimasto dopo la replicazione, anche il
nuovo filamento sarà mutato nello stesso sito
1) Si rompe il DNA con endonucleasi
2) Si digeriscono singoli filamenti in direzione
5 con esonucleasi
23
Progressi nel sequenziamento
Sequenziamento del DNA di singoli cromosomi
2) Colorazione con 2 fluorocromi, rispettivamente
specifici per A-T e G-C, la cui emissione
risultante è specifica per ciascun cromosoma
1) Raccolta di cromosomi in metafase con shock
osmotico
Isolamento di singoli cromosomi con citometria a
flusso
3) Singoli cromosomi contenuti in microgocce sono
riconosciuti da sensori laser
4) Si effettua lelettroforesi dei nuovi
filamenti
Sequenziamento automatico del DNA
1) Si dispone di singoli filamenti di DNA con
primer e DNA polimerasi
3
primer
G
AGGTTAC
T
A
2) Si forniscono miscele di nucleotidi contenenti
di-desossi-nucleotidi, privi di OH al C3, che
bloccano lallungamento del nuovo filamento di DNA
A
C
C
T
ddA
ddG
ddC
ddT
5
4) ricevono una carica elettrica specifica
TCCAATG
5
3
3) Ciascun di-desossinucleotide è marcato con un
fluorocromo specifico
5) e sono deviati da un campo elettrico nella
propria provetta
5) e mediante spettroscopia automatica, si
ottiene il profilo della sequenza
24
Dalla mappatura al sequenziamento del genoma
Sequenziamento clone dopo clone
Marcatori molecolari
Alleli dei siti di restrizione (RFLP)
1) Mappatura di restrizione (fingerprinting) di
una raccolta di grandi cloni da una genoteca,
identificando le sovrapposizioni
Sito di restrizione
Trattamento con lenzima di restrizione
Allele non tagliabile
Alleli per singole sostituzioni nucleotidiche
(SNP)
2) Selezione del numero minimo di cloni
sovrapposti
3) Frammentazione in sub-cloni dei grandi cloni
superstiti e loro sequenziamento
Identificati per sequenziamento
Alleli per numero di ripetizioni di mini- e
microsatelliti (SSLP)
Sequenziamento shotgun
1) Frammentazione di genomi in genoteche di cloni
di diversa grandezza
Mappature di marcatori molecolari fra loro/con
geni
Mappe genetiche (ricombinazione)
2) Sequenziamento di successivi campioni casuali
di cloni di diversa grandezza e analisi
automatizzata delle sequenze sovrapposte (prova
ed errore)
Mappe cromosomiche ibridazione in situ con sonde
fluorescenti (FISH)
Mappe fisiche sequenziamento del genoma
25
Genomica strutturale
Il sequenziamento del genoma utilizza le
metodiche già descritte seguendo diverse fasi
1 compilazione consiste nella ripetizione per
numerose volte dellintero processo per riempire
le lacune e correggere gli errori dovuti alla
natura empirica e casuale del processo
Le lacune, oltre agli errori di metodo, sono
dovute a regioni difficilmente sequenziabili DNA
satellite e geni ripetuti in tandem
2 annotazione consiste nellidentificazione di
presunti geni, riconoscibili come open reading
frames (ORF), nel caso di codificazione di
polipeptidi
Le ORF iniziano con codoni di inizio traduzione
(sul filamento trascritto 3TAC5, su quello
complementare 5ATG3) e , dopo numerose
triplette, terminano con codoni di stop.
In un tratto di DNA sequenziato per la ricerca di
ORF sono possibilli 3 tentativi di lettura,
sfalsati di un nucleotide, per ciascuno dei due
filamenti complementari.
3 verifica delle ORF consiste nella ricerca in
prossimità delle ORF di altre sequenze funzionali
(promotori negli eucarioti siti di splicing, di
poliadenilazione etc.).
Solo il 5 del genoma umano consiste nei suoi
circa 26.000 geni il 10 consiste in DNA
satellite, il 50 in elementi trasponibili
interspersi.
Oggi sono disponibili software sofisticati che
minimizzano gli errori, tenendo conto di
caratteristiche note del genoma (p. es.
abbondanza di isole CpG- 5CG3 in prossimità
di geni)
26
Genomica funzionale e proteomica
Genomica funzionale
Data lestrema maggiore ricchezza del repertorio
proteico (proteoma) di un organismo rispetto al
genoma, è utile indagare il proteoma nel suo
complesso.
1) Una volta identificata una ORF come possibile
gene, per verificare la funzione del polipeptide
codificato si ricorre a banche dati di sequenze
geniche note.
Si effettua unelettroforesi bidimensionale del
proteoma espresso in determinate condizioni
ambientali di una popolazione cellulare.
2) Si effettua un confronto dettagliato con i
geni simili trovati.
Si possono ottenere 102 -104 diverse macchie.
3) Si analizzano i motivi funzionali dei
polipeptidi codificati, con lausilio di banche
dati di catene polipeptidiche.
Una volta isolata una proteina nel proteoma,
prelevandola dal gel, la si tenta di identificare
con una digestione parziale e il confronto con
banche dati di catene polipeptidiche e loro
frammenti.
Ancora oggi per moltissime ORF dei genomi finora
sequenziati non è stata definita una funzione.
Microarray a DNA
Gli oligonucleotidi di ciascuna riga riguardano
lo stesso gene, con lallele normale e diverse
mutazioni.
Su una lastra sono collocati 104 -105 pozzetti,
ciascuno con un oligonucleotide a singolo
filamento di DNA.
Il/i gene/i da saggiare è amplificato per PCR,
coniugato con fluorocromi e collocati sul
microarray.
Solo sequenze complementari si legheranno ai
pozzetti, rivelando eventuali mutazioni.
27
Genetica diretta e genetica inversa
Genetica diretta
Genetica inversa
1) Si inducono mutazioni casuali (con radiazioni,
sostanze chimiche, elementi trasponibili).
1) Si isola e si sequenzia una proteina la cui
funzione deve essere indagata).
2) Si effettua uno screening genetico, attrverso
test specifici, per riconoscere i mutanti.
2) Si determinano le possibili sequenze di cDNA,
costruendo un corredo di oligonucleotidi.
3) Si assegnano i nuovi mutanti ai propri gruppi
di complementazione, identificando il gene mutato.
3) Si saggiano gli oligonucleotidi con i cloni di
una ganoteca, identificando il gene putativo.
4) Si analizza il ruolo delleventuale nuovo gene
nella rete di interazioni fra geni (epistasi,
soppressione etc.).
4) Si confronta la sequenza polipeptidica
codificata dal gene putativo con sequenze
presenti in banche dati, cercandone i motivi
funzionali.
5) Si mappa il gene, prima costruendo una mappa
genetica, quindi una mappa fisica.
5) Si costriscono mutanti knock out (con
perdita di funzione, spesso delezioni
intrageniche) o con sostituzione genica, mediante
mutagenesi sito-specifica e se ne studiano gli
effetti fenotipici.
6) Si clona e si sequenzia il gene.
6) Si possono usare gli siRNA per inattivare i
geni bersaglio, al posto dei mutanti knock out
(silenziamento epigenetico