TRAFIC V

1
TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE
2
Moyens de communication de la cellule avec
l'environnement

• Procaryotes
• Tout passe par la membrane plasmique
• Eucaryotes
• Endocytose
• milieu extra cellulaire ? lysosomes ? digestion ?
  métabolites dans le cytosol
• Exocytose voie sécrétoire
• synthèse de nouvelles molécules ? compartiments ?
  surface

3
Fig 13-1

• Les voies endocytaire et sécrétoire
• voie endocytaire
• voie sécrétoire
• voies de retour

4
La lumière

• Espace compris à l'intérieur d'un compartiment
  limité par une membrane
• Topologiquement toutes équivalentes entre elles
  et avec l'espace extra cellulaire

5
Rôle de la voie endo/exo-cytaire

• Modification des molécules qui seront sécrétées
  vers l'extérieur
• Connections (indirecte) de la membrane plasmique
  au réticulum endoplasmique

6
Topologie des membranes

• Les lumières sont équivalentes
• Le transport se fait par vésicules

7
Le cargo

• Molécule luminale ou membranaire qui est
  transportée par la vésicule

8
Fig 13-2

• Transport vésiculaire
• maintien de l'asymétrie de la membrane
• pas de membrane à traverser pour les molécules
  solubles

Fusion des feuillets bleus
Fusion des feuillets rouges
9
Fig 13-3
Recirculation
Voie endocytaire
Golgi ? RE Endos tardif ? Golgi Endos précoce ?
membrane
Voie sécrétrice

• Compartiments intracellulaires impliqués dans les
  voies endo/exo-cytaires

10
Équilibre entre les compartiments

• Entrées sorties
• Pour les membranes et pour les cargos ?
• Un aller ? un retour
• Sélectivité
• Des cargos transportés
• Des destinations

11
TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE

1. Les mécanismes moléculaires du transport par
   membrane et le maintien de la diversité des
   compartiments
2. Transport à partir du réticulum endoplasmique à
   travers le Golgi
3. Transport du TGN vers les lysosomes
4. Transport de la membrane plasmique vers
   l'intérieur de la cellule endocytose
5. Transport du TGN vers l'extérieur de la cellule
   exocytose

12
TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA CELLULAIRE

• I - Les mécanismes moléculaires du transport
  membranaire et le maintien de la diversité des
  compartiments
• Phénomènes de bourgeonnement et fusion
• Maintien des différences entre les compartiments

13
Problème

• Échange permanent entre les compartiments ?
  mélange des molécules ? tous les compartiments
  finiront pas être identiques

14
La solution

• Marqueurs moléculaires exprimés à la surface
  cytosolique des membranes

15
Méthodes d'approche

• Systèmes sans cellules
• Protéines de fusion avec la GFP
• Génétique

16
Systèmes sans cellules

• Population donneuse
• cellules mutantes qui n'ont pas
  N-acétylglucosamine transférase I
• infectées par un virus (donc glycoprotéine virale
  présente)
• pas de glycoprotéine virale porteuse de
  N-acétylglucosamine
• Golgi accepteur
• possède N-acétylglucosamine transférase I (type
  sauvage)
• non infecté par le virus donc pas de
  glycoprotéine virale
• Mélange des deux
• présence de glycoprotéine virale porteuse de
  N-acétylglucosamine ?
• Il a fallu qu'il y ait transport

17
Protéines de fusion avec la GFP
18
Génétique

• Protéines thermosensibles codées par des mutants
• Phénomène de suppression multicopies

19
Éléments d'approche

1. Les types de vésicules
2. Assemblage du manteau (les GTPases)
3. Guidage du transport (les SNARE)
4. Amarrage (protéines Rab)
5. Fusion

20
Éléments d'approche

1. Les types de vésicules
2. Assemblage du manteau (les GTPases)
3. Guidage du transport (les SNARE)
4. Amarrage (protéines Rab)
5. Fusion

21
1 - Les types de vésicules

• Vésicules recouvertes sur leur face cytosolique
• Bourgeonnement
• Perte du manteau
• Fusion des membranes

22
Les deux rôles du manteau

• Concentration de protéines membranaires dans un
  patch qui formera la vésicule ? permet la
  sélection des molécules à transporter
• Moule la vésicule qui aura ainsi toujours à peu
  près la même taille

23
Les trois types de manteau des vésicules
recouvertes

• Clathrine
• COPI
• COPII

24
Fig 13-4

• Les trois types de manteau des vésicules
  recouvertes

25
Utilisation des différents manteaux dans le
trafic vésiculaire

• Clathrine à partir du Golgi et à partir de la
  membrane plasmique
• au moins trois types de vésicules à clathrine
• COPI et COPII à partir du RE et du Golgi
• Beaucoup d'autres

26
Fig 13-5

• Utilisation des différents manteaux dans le
  traffic vésiculaire

27
Éléments d'approche

1. Les types de vésicules
2. Assemblage du manteau (les GTPases)
3. Guidage du transport (les SNARE)
4. Amarrage (protéines Rab)
5. Fusion

28
2 - Assemblage du manteau

• a - Exemple clathrine
• Le plus étudié
• (b - COPI et COPII)

29
Fig 13-6

• Puits et vésicules recouverts de clathrine en
  congélation sublimation rapide

30
Clathrine

• Une sous-unité de clathrine
• 3 grosses chaînes
• 3 petites chaînes
• Une sous-unité un triskélion
• Assemblage des triskélions en un panier
  d'hexagones et pentagones
• Triskélions peuvent s'assembler spontanément en
  panier même sans membrane

31
Fig 13-7

• Manteau de clathrine

32
Manteau de clathrine

• Un manteau 36 triskélions (sans la vésicule)
• 12 pentagones 6 hexagones
• Formation de deux coquilles
• externe
• interne domaines N-terminaux des chaînes
  lourdes où se fixent les adaptines
• Sur une vésicle 12 pentagones beaucoup plus
  d'hexagones

33
Adaptine

• Protéine de manteau à clathrine
• Complexe multiprotéique
• Lie la clathrine à la membrane
• Piège les protéines transmembranaires dont les
  récepteurs qui capturent les cargos solubles
• Au moins 4 types d'adaptine pour les différents
  récepteurs de cargo

34
Fig 13-8

• Assemblage et désassemblage d'un manteau de
  clathrine
• Les adaptines se lient à la clathrine et au
  complexe cargo/cargo-r
• Dynamine GTPase

35
Pincement de la membrane

• Dynamine autres protéines
• Fusion des feuillets non cytosoliques (grâce à la
  dynamine)

36
Fig 13-9

• Rôle de la dynamine
• Puits à clathrine dans les cellules nerveuses de
  drosophiles shibire ayant une mutation du gène de
  la dynamine entraînant une paralysie. Anneau
  correspondant à la dynamine mutée

37
Perte du manteau

• La vésicule quitte la membrane
• Le manteau de clathrine est perdu immédiatement
• intervention de chaperonne de la famille des
  hsp70 (ATPase)
• auxilline active l'ATPase
• La vésicule doit attendre d'être constituée pour
  que le manteau se retire

38
Spécificité du manteau

• Mécanismes généraux identiques
• Mais chaque membrane a ses spécificités
• membrane plasmique (riche en cholestérol)
  nécessité de beaucoup d'énergie
• autres membranes existence de bourgeonnements

39
b - Protéines autres que la clathrine

• CopI 7 sous-unités protéiques
• analogies avec adaptine
• Bourgeonnement à partir du Golgi
• CopII 4 sous-unités protéiques
• Bourgeonnement à partir du RE
• (a Clathrine)

40
Toutes les vésicules ne sont pas sphériques

• Membranes contenant des protéines fluorescentes
• Long tubules qui émanent de endosomes et réseau
  trans-golgien (TGN)
• Ces tubules peuvent servir de transporteurs
  (grand rapport surface / volume)
• "une vésicule peut être tubulaire !"

41
c Contrôle de l'assemblage du manteau GTPases
monomériques, rappel
42
c Contrôle de l'assemblage du manteau GTP
binding proteins (rappel)

• GTP binding proteins
• 2 états
• Actif avec liaison de GTP
• Inactif avec liaison de GDP
• 2 types
• Monomérique ( GTPases monomériques) les mieux
  connues
• Trimérique ( GTPases trimériques protéines G)
• Passage d'un état à l'autre par
• GEFs (Guanine-nucleotide-Exchange Factors) GDP ?
  GTP
• GAPs (GTPase-Activating Proteins) GTP ? GDP

43
Fig 13-10

• Formation d'une vésicule à COPII (RE)

GTPase monomériquerecruteuse de manteau
Sar 1-GTP recrute COPII vers la membrane
Sec12
44
GTP binding proteins (Rappel)

• Monomérique
• GTPases
• GTPases de recrutement du manteau
• Protéines ARF (ADP Ribosylation Factor)
• Assemblage COPI et clathrine au Golgi
• Protéine Sar 1
• Assemblage COPII au réticulum endoplasmique
• ?
• Assemblage clathrine à la membrane plasmique
• Rab amarrage des protéines de transport
• Etc
• Etc
• Trimériques
• Protéines G

45
Formation of secretory vesicles in the
biosynthetic pathway ReviewSylvie Urbé, Sharon
A. Tooze and Francis A. BarrBiochimica et
Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research
Volume 1358, Issue 1 , 21 August 1997, Pages 6-22

• Protéines de formation des vésicules recouvertes
  de COP I- et COP II

46
GTPases de recrutement du manteau les acteurs

• Membrane du RE
• Sar 1 GDP ( GTPases de recrutement du manteau)
  forte concentration, cytosolique, inactive
• GEF (Guanine-nucleotide-Exchange Factor)

47
GTPases de recrutement du manteau la séquence

• Une vésicule à COPII est sur le point de
  bourgeonner (du RE)
• Une GEF spécifique (protéine de membrane du RE
  appelée Sec 12) se lie à la Sar 1 du cytosol
• et remplace le GDP de la Sar 1 par du GTP
• La Sar 1 GTP libère une queue d'acide gras lui
  permettant de se fixer dans la membrane du RE
• puis recrute des sous-unités de COPII
• La membrane bourgeonne en incluant des protéines
  membranaires sélectionnées

48
Fig 13-10

• Formation d'une vésicule à COPII

49
Désassemblage du manteau

• GTPases de recrutement du manteau
• Hydrolyse du GTP en GDP
• La queue est exclue de la membrane
• ? désassemblage du manteau
• C'est le temps qui finit par déclencher
  l'hydrolyse

50
Éléments d'approche

1. Les types de vésicules
2. Assemblage du manteau (les GTPases)
3. Guidage du transport (les SNARE)
4. Amarrage (protéines Rab)
5. Fusion

51
3 - Guidage du transport

• Reconnaissance vésicule de transport ? membrane
  cible
• Toutes les vésicules de transport ont des
  marqueurs de surface spécifiques de leur origine
  et de leur cargo
• Les membranes cible ont des récepteurs
  complémentaires

52
Reconnaissance vésicule de transport ? membrane
cible

• SNAREs
• Spécificité
• Catalyseur de la fusion
• Rabs (GTPases cible)
• Amarrage initial
• Fixation de la vésicule
• En collaboration avec d'autres protéines

53
rab GTP-Binding Proteins

• A large family of MONOMERIC GTP-BINDING PROTEINS
  that play a key role in cellular secretory and
  endocytic pathways

54
Abréviations

• SNAREs SNAP receptors
• SNAPs soluble NSF attachment proteins
• NSF N-ethylmaleimide-sensitive-fusion protein

55
Fig 13-11

• Rôle des SNAREs dans le guidage des vésicules de
  transport

56
SNAREs

• Au moins 20 espèces différentes
• Protéines trans-membranaires
• Marchent par deux
• v- SNAREs (vesicle)
• t- SNAREs (target cible)
• Domaine hélicoïdal qui s'enroule l'un dans
  l'autre ? complexe transSNARE qui contribue à la
  fusion des membranes

57
Complexe transSNARE

• Toujours 4 hélices ?
• 3 formées par t-SNARE
• 1 formée par v-SNARE
• Ici 3 protéines
• v-SNARE 1 hélice (synaptobrévine)
• t-SNARE 1 hélice (syntaxine)
• t-SNARE 2 hélices (Snap25 protéine
  périphérique)

58
Fig 13-12

• Structure de SNAREs appariés dans les
  terminaisons nerveuses

59
SNAREs nerveuses

• Cibles de neurotoxines
• Tétanos
• Botulisme
• Protéases qui entrent dans des neurones
  spécifiques, clivent les SNAREs et bloquent la
  transmission synaptique

60
Désassemblage du complexe trans-SNARE

• Après fusion le complexe SNARE est stable dans la
  membrane
• Doit être désassemblé ?
• NSF (N-ethylmaleimide-sensitive-fusion protein)

61
NSF

• Cycle entre les membranes et le cytosol
• Catalyse le désassemblage
• ATPase
• Ressemble à une chaperone cytosolique qui
  solubilise et aide à replier correctement les
  protéines dénaturées
• Déroule les hélices des SNAREs
• en collaboration avec des protéines adaptatrices

62
Fig 13-13

• Dissociation d'une paire v-SNARE t-SNARE par NSF
  une fois le cycle de fusion terminé
• NSF des protéines adaptatrices ? hydolyse ATP
  séparation des SNAREs
• La dissociation régule quand et où les membranes
  vont fusionner

63
Éléments d'approche

1. Les types de vésicules
2. Assemblage du manteau (les GTPases)
3. Guidage du transport (les SNARE)
4. Amarrage (protéines Rab)
5. Fusion

64
4 Amarrage

• Rôle important des protéines Rab dans la
  spécificité du transport vésiculaire

65
Protéines Rab

• GTPases monomériques
• Plus de 30 membres ? la plus grande sous-famille
  de GTPases monomériques
• Distribution caractéristique sur les membranes
  cellulaires
• Chaque organite a au moins une protéine Rab sur
  sa face cytosolique
• Facilitent et régulent
• Le taux d'amarrage des vésicules
• et l'appariement des v- t- SNAREs

66
Table 13-1

• Localisation sub-cellulaire de quelques protéines
  Rab

67
Localisation sub-cellulaire de quelques protéines
Rab
Rab1 RE et Golgi
Rab2 cis Golgi network
Rab3A vésicules synaptiques, granules sécrétoires
Rab4 endosomes pécoces
Rab5A membrane plasmique, vésicules à manteau de clathrine
Rab5C early endosomes tardifs
Rab6 citernes médianes et du trans Golgi
Rab7 endosomes tardifs
Rab8 vésicules sécrétoires (basolateral)
Rab9 endosomes tardifs, trans Golgi network
68
Protéines Rab

• Comme les GTPases de recrutement du manteau elles
  cyclent entre la membrane et le cytosol
• Comme les GTPases de recrutement du manteau, 2
  états
• Inactif avec liaison de GDP dans le cytosol
• Actif avec liaison de GTP associé à une membrane

69
c Contrôle de l'assemblage du manteau GTP
binding proteins (rappel)

• GTP binding proteins 2 états
• Actif avec liaison de GTP
• Inactif avec liaison de GDP
• Passage d'un état à l'autre par
• (GEFs) GDP?GTP (monomérique GTPase )
• GTPase-Activating Proteins (GAPs) GTP?GDP
  (trimérique protéines G) Guanine-nucleotide-Exch
  ange Factors

70
Fig 13-14

• Rôle des protéines Rab dans l'amarrage des
  protéines de transport

Sar1?COPII?formation de la vésiculeRab?SNARE
?amarrage de la vésicule
71
Les effecteurs de Rab (1/2)

• Reconnaissance de Rab (Lié, GTP) par un Rab
  effecteur
• Gros complexe protéique
• Très variable d'une protéine Rab à une autre

72
Les effecteurs de Rab (2/2)

• Parfois longues protéines filamenteuses qui
  limitent le mouvement des vésicules entre des
  citernes golgiennes adjacentes
• Se lient à Rab et empêchent l'hydrolyse
  prématurée du GTP
• D'autres sont des moteurs qui dirigent les
  vésicules vers leur destination

73
Protéines Rab

• Agissent sur les protéines de contrôle des SNAREs
• Accélèrent le processus de reconnaissance des
  SNAREs entre elles
• Achèvent le verrouillage de la vésicule à sa
  cible par appariement des SNAREs ?
• prêt pour la fusion
• Après la fusion, la protéine Rab hydrolyse son
  GTP lié
• et retourne dans le cytosol

74
Éléments d'approche

1. Les types de vésicules
2. Assemblage du manteau (les GTPases)
3. Guidage du transport (les SNARE)
4. Amarrage (protéines Rab)
5. Fusion

75
5 Fusion

• Distinguer amarrage de fusion
• Fusion ne fait pas toujours suite à amarrage
• eg exocytose régulée
• Amarrage les protéines des membranes
  interagissent et adhèrent
• Fusion les couches lipidiques peuvent se
  joindre ? nécessité d'extrusion d'eau ? protéines
  de fusion pour résoudre le problème énergétique
  (? dynamine au cours du bourgeonnement des
  vésicules à clathrine)

76
Fig 13-15

• Modèle de concentration des protéines SNAREs au
  cours de la fusion de membrane
• Des liposomes (in vitro) v-SNAREs des liposomes
  t-SNAREs ? fusion lente ?
• Intervention (dans la cellule) d'autres protéines
• pour initier la fusion
• ou pour retirer des protéines inhibitrices

77
Importance des phénomènes de fusion de membrane

• Transport vésiculaire
• Fécondation (fusion oolemme spermatozoïde)
• Fusion des myoblastes
• Maintien de l'identité des cellules
• Maintien de l'identité des compartiments
  intra-cellulaires
• Mode d'entrée des virus à enveloppe dans les
  cellules

78
Analogie protéines de fusion virales ? SNAREs

• Human Immunodeficiency Virus (HIV)
• Se lie aux récepteurs de la surface de la cellule
• Les membranes de la cellule et du virus
  fusionnent
• L'acide nucléique viral entre dans la cellule et
  s'y réplique
• Virus influenza
• Entrée du virus dans la cellule par endocytose
• Arrivée dans l'endosome
• Activation d'une protéine de fusion de
  l'enveloppe virale
• Fusion de la membrane virale et de la membrane
  endosomale
• L'acide nucléique viral entre dans le cytosol et
  s'y réplique

79
Fig 13-16

• Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule

80
Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule

• Liaison de HIV à la protéine CD4 à la surface des
  lymphocytes
• par lintermédiaire de la protéine virale gp120
  liée à la protéine de fusion de HIV
• Une 2ème protéine de surface de la cellule hôte
  qui sert normalement de récepteur aux chimiokines
  agit avec gp120 ?
• Séparation de gp120 et de la protéine de fusion ?
• Enfouissement de la partie hydrophobe de la
  protéine de fusion dans la membrane
• La protéine de fusion (trimère) se comporte
  transitoirement comme une protéine de membrane
  dans deux membrane opposées ?
• Réarrangement spontané de la protéine de fusion
  qui se collabe en une structure compacte de 6
  hélices ?
• Libération dénergie ? rapprochement des membranes

81
Résumé

• Les manteaux
• GTPases (Sar1 et ARF)
• GTPases (Rab)
• SNAREs

82
(No Transcript)
83
(No Transcript)