TRANSGENU DZIVNIEKU IEGU

1
TRANSGENU DZIVNIEKU IEGUŠANA UN IZMANTOŠANA
BIOTEHNOLOGIJA
Transgeni, cilmes šunas, nokauti un kloni
2
JAUTAJUMI

1. Agrina embriogeneze un cilmes šunas
2. Vienkaršie transgeni
3. Genu nokauti
4. Dzivnieku kloni
5. Pieaugušas cilmes šunas un audu inženierija

3
Transgenu dzivnieku iegušana

• Transgenie dzivnieki tiek ieguti, izmantojot tris
  metodes
• Genu mikroinjekcija apauglotas olšunas
  pronukleusa,
• embrionalo cilmes šunu injekcija blastocista,
• apstrade ar retrovirusiem.

http//www.ag.uiuc.edu/vista/html_pubs/irspsm91/t
ransfor.html
4
Transgenu dzivnieku iegušana
5
Transgenu dzivnieku iegušana
Pirmo metodi plaši izmanto transgenu pelu
iegušanai. Pec mikroinjekcijas no peles iznem
nesen apauglotus vienšunas embrijus. šim nolukam
izmanto mikromanipulatorus un ipaši aprikotu
mikroskopu. Ar specialu pipeti un vakuma
palidzibu embriju fikse, un tas pronukleusa ar
kapilaru adatu ievada klonejamo DNS. Pec tam
embrijus parnes aizvietotajmates, kuras tos
iznesa. 1 4 no injicetajiem embrijiem dod
transgenus pecnacejus.
6
Zigotas veidošanas
Olšunas ietver apvalki vitelina membrana (zona
pellucida ziditajdzivnie-kiem) un folikularo šunu
slanis (corona radiata ziditajdzivnie-kiem).
bartleby.com/ 107/5.html
7
Agrina embriogeneze
8
Agrina embriogeneze
Oocits gt Zigota gt Blastomers/Paršunu stadijas gt
Morula gt Blastocists gt Gastrula gt Embrijs
9
Transgenu dzivnieku iegušana
10
Transgenu dzivnieku iegušana
Otra metode. No blastocista (dažas dienas pec
apauglošanas) iegust embrionalas cilmes (EC)
šunas. Tas var audzet neierobežoti ilgi
laboratorija un tas nezaude speju augt un
diferenceties par jebkuru dzivnieka audu tipu,
veidot veselu jaunu dzivnieku. EC šunas in vitro
transforme ar svešajiem geniem un ar
mikroinjekciju ievada cita blastocista.
Aizstajejmates iznesa dzivniekus, kurus veido
divu dažadu tpu šunas, transgenas un parastas. Ja
transgenas EC šunas ir veidojušas dzivnieku
spermatozoidu vai olšunu priekštecus šadu
dzivnieku pecteci visi bus transgeni.
11
Cilmes šunas Cilmes šunas ir relativi vienkaršas
šunas, kuras spej atri augt, neierobežoti ilgi
dalities šunu kultura un diferenceties par
specializetam šunam. Izškir embrionalas cilmes
šunas pieaugušas (somatiskas) cilmes šunas
12
Cilmes šunu diferencešanas potencials totipotent
as (zigota) pluripotentas (embrionalas) multi
potentas (pieaugušas).
13
Embrionalas cilmes šunas
Priekšrocibas vieglak izmantot neierobežoti
ilgi aug kultura nerada imuno atbildi. Trukumi t
eratomas (?)etiskas problemas.
14
EC ŠUNAS
15
EC ŠUNAS
16
Transgenu dzivnieku iegušana
17
ES ŠUNAS
18
Treša metode ar retrovirusu palidzibu
19
Vienkaršie transgeni
Nejauša integracija Tandemu un polimeru
veidošanas Regulešanas problemas Apklusinašana /
delecijas / metilešana
20
Vienkaršie transgeni
Transgenu identificešana un integracijas vietas
lokalizešana fenotips Southern
analize PCR FISH
21
Vienkaršie transgeni
Parnesto genu regulešanas problemas
inducejami promoteri enhanseru
lokalizacija izolatoru -MAR domenu
loma lokusa (pozicijas) efekts lokalizacijas
sekvences
22

• Transgena ekspresiju kave
• cDNS, nevis hromosomalas DNS klonešana
• integracija liela kopiju skaita
• bagatas sekvences (dzivniekiem neraksturigas)
• (4) integracija vaji ekspresejama rajona-
  pozicijas efekts.

23
Vienkaršie transgeni
Parnesto genu apklusinašana delecijas
(Southern analize) metilešana
5-meC atlikums 5-CCGG-3 secibas, pieradišana ar
genoma un kimisko sekvenešanu (DMS un tiosulfata
apstrades jutiba)
24
Izolatori LCR secibas (locus control
regions) Genu grupas tiek nodalitas no parejas
hromosomas ar specifiskam izolatoru DNS
secibam. Izolatorus veido vairaki elementi
a) sailenseri, kas bloke integreta transgena
tuvuma esošo enhanseru darbibu b) hromatina
atšketinataji, kas induce histonu deacetilešanu,
ko pavada lokala histonu un DNS demitelešana c)
AT- bagati matriksa saistibas rajoni (MAR,
matrix-attached regions).
25
Parnesto genu regulešanas problemas
26
TRANSGENIE DZIVNIEKI Nozimigakie procesi
attistibas biologija no farming uz pharming
klonešanaakvakultura Izmantojamie organismi
un produkti visbiežak zivis govis un
jaunus proteina veidus saturošs piens
perspektiva dzivnieki ar iznicinatu prionu
proteinu genu. Merki ražošanas efektivitate
funkcionala (terapeitiska) partika, partikas
drošiba.
27
FARMING VIETA PHARMING
http//www.nal.usda.gov/bic/Education_res/iastate.
info/bio10.html
28
FARMING VIETA PHARMING
29
GM DZIVNIEKU PIENA SINTEZETIE PROTEINI
30
PELU SLAUKŠANA
Pelem intraperitoneali injice oksitocinu (lidz 5
IU). Pec tam, ar precizi regulejama vakuma
pievadišanu piena dziedzeriem, iespejams iegut
lidz 1 ml piena. Izmantojot lidzigu metodi, no
trušu matem laktacijas perioda iespejams iegut
lidz 100 ml piena diena. Lidzigus daudzumus
piena iespejams iegut ari no izoletiem piena
dziedzeriem.
31
PIRMAIS TRANSGENAIS DZIVNIEKS
32
Cukas, kas siekalas eksprese bakteriju enzimu
fitazi izdala vide ap 75 mazak fosfatu neka
parastas cuku škirnes, tadejadi ieverojami
samazinot lopkopibas radito piesarnojumu.
Golovan SP, Meidinger RG, Ajakaiye A, Cottrill M,
Wiederkehr MZ, Barney DJ, Plante C, Pollard JW,
Fan MZ, Hayes MA, Laursen J, Hjorth JP, Hacker
RR, Phillips JP, Forsberg CW. Pigs expressing
salivary phytase produce low phosphorus manure.
Nat Biotechnol 2001, 19 741745.
33
Fitats inozitolheksafosfats Viena no
galvenajam fosfora uzkrašanas formam augos, ipaši
kviešos. Stiprs helatejošs savienojums, saista
divalentos katjonus, piem., Ca2.
Tiek noardits atgremotaj dzivnieku kungi, citu
dzivnieku gremošanas trakta ne. Bakterijas,
noardot fitatu fermu atkritumos, piesarno
notekudenus ar fosforu.
34
Cukas, kas eksprese spinatu enzimu desaturazi
uzkraj vairak nepiesatinatu taukskabju, tadejadi
paaugstinot galas kvalitati.
Saeki K, Matsumoto K, Kinoshita M, Suzuki I,
Tasaka Y, Kano K, Taguchi Y, Mikami K,
Hirabayashi M, Kashiwazaki N, Hosoi Y, Murata N,
Iritani A. Functional expression of a Delta12
fatty acid desaturase gene from spinach in
transgenic pigs. Proc Natl Acad Sci USA 2004,
101 63616366.
35
Paredzams, ka kazas un govis, kas piena ekspreses
tadus bakterijas nonavejošus proteinus ka cilveka
lizocimu, laktoferinu un lizostafinu bus mazak
jutigas pret mastitu. To piens bus izturigaks
pret bojašanos bakteriju iedarbiba un to vares
lietot cilveki, kas slimo ar bakterialam
infekcijam.
Kerr DE, Plaut K, Bramley AJ, Williamson CM, Lax
AJ, Moore K, Wells KD, Wall RJ. Lysostaphin
expression in mammary glands confers protection
against staphylococcal infection in transgenic
mice. Nat Biotechnol 2001, 19 6670. Murray J,
Reh W, Anderson G, Maga E. Changing the
composition of milk to improve human health. In
Transgenic Animal Research, Conference IV, Tahoe
City California, 2003, p 32.
36
Transgenas vistas Vistas aug atrak neka aitas un
tas var turet liela skaita salidzinoši mazas
platibas. Vistas olas baltums satur vairakus
gramus proteina. Lidz šim izmantotas divas
metodes, lai iegutu vistas, kas nes un eksprese
svešus genus. 1 ) Embrijus infice ar virusa
neseju, kas satur terapija izmantojama cilveka
proteina genu un vistas gena (piem., lizocima)
promotera secibas, kas nodrošina proteina
uzkrašanu olas baltuma. 2) Ar cilveka genu un
atbilstošiem promoteriem transforme gailu
spermatozoidus. Orientejoši dati rada, ka vistas
var producet lidz 0,1 gramam cilveka proteina
katra izdetaja ola
37
TRANSGENI DZIVNIEKI PARTIKAI UN SKAISTUMAM
Atri augošs, lets, barojošs un videi draudzigs
"AquAdvantage" lasis
Aqua Bounty Technologies, Bostonas priekšpilseta,
2003. g. oktobri pieprasijums FDA In September
2010, an FDA advisory panel indicated that the
fish is "highly unlikely to cause any significant
effects on the environment" and that it is "as
safe as food from conventional Atlantic salmon"
38
TRANSGENI DZIVNIEKI PARTIKAI UN SKAISTUMAM
Sarti fluorescejošas zebru zivtinas ir vai nav
partika ?
39
TRANSGENI DZIVNIEKI PARTIKAI UN SKAISTUMAM
40
GENU NOKAUTI
Genu nokauts organisma modifikacija, kas ar
merketu deleciju vai inserciju palidzibu inaktive
specifisku genu. Genu nok-ins organisma
modifikacija, kas ar merketu inserciju novieto
funkcionejošu genu lokusa, kur atrodas ta paša
gena nefunkcionejoša kopija.
41
NOKAUTI
42
NOKAUTI
43
NOKAUTI
44
CRE - LOX SISTEMA NOKAUTOS
45
CRE - LOX SISTEMA NOKAUTOS
46
CRE - LOX SISTEMA NOKAUTOS
47
ESTROGENU-INDUCEJAMI NOKAUTI
48
TET-INDUCEJAMI NOKAUTI
49
GENETISKAIS FONS UN NOKAUTU FENOTIPS
50
KLONEŠANA Organismu vai šunu kopiju savairošana
vegetativa (bezdzimuma) cela Reproduktiva
klonešana Reproduktivas klonešanas merkis ir
radit dzivnieku, kuram ir tada pati DNS ka kadam
citam dzivniekam. To panak parnesot somatiskas
šunas kodolu uz olšunu, kuras pašas kodols ir
iznicinats. Terapeitiska klonešana Terapeitiskas
klonešanas merkis ir radit slimas personas audu
vai organu veselu kopiju transplantacijas nolukam.
51
KLONEŠANA
Koloniju veido 108 - 109 šunu
52
KLONEŠANA
53
DZIVNIEKU KLONEŠANA
54
DZIVNIEKU KLONEŠANA
1997. gada 27. februari Nature publice rakstu
par Dolliju Finn Dorset škirnes aitu, kas
ieguta, sapludinot 6 gadus vecas aitas tesmena
šunas ar bezkodola Skotu melngalvainas aitas
oocitu.
55
DZIVNIEKU KLONEŠANA
Dollijas klonešanu firmas PPL Therapeutics Roslin
laboratorijas vadija skotu zinatnieks Jans
Vilmuts (Ian Wilmut)
56
Ian Wilmut un Keith Campbell ar lidzstradniekiem
Roslin Instituta un Edinburgas biotehnologijas
firma PPL therapeutics izmantoja modificetu
kodola parneses metodi, iegustot dzivotspejigu
aitu no kodola materiala, kas bija nemts no 6
gadus vecas grusnas aitas tesmena šunas. Olšunas
ar nomainitiem kodoliem uzsaka dalities un
veidoja 29 daudzšunu embrijus, kurus parnesa 13
aizvietotajmates. Pec 148 dienam piedzima viena
aita, kuru Roslina instituta darbinieki nosauca
par Dolliju par godu savai iemilotajai kantri
dziedatajai Dolly Parton.
http//www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pag
es/Lecture20/Lecture20-text.pdf
57
DZIVNIEKU KLONEŠANA
58
DZIVNIEKU KLONEŠANA
OLŠUNAS KODOLA AIZVAKŠANA
59
DZIVNIEKU KLONEŠANA
Dollija ar tevu un berniem
60
DZIVNIEKU KLONEŠANA
1997. gada 7. augusta tika zinots par pirma no
embriona-liem fibroblas-tiem kloneta Holšteinas
škirnes tela iegušanu.
Telš varda Gens tika klonets firmas Animal
Breeding Systems Global laboratorijas
Viskonsina, ASV
61
DZIVNIEKU KLONEŠANA
AP, 24.01.2000, No aizmugure stavoša bulla auss
klonetie teli, Japana
62
DZIVNIEKU KLONEŠANA
AP, 02.05.2000, Advanced Cell Technologies,
Australija
63
(No Transcript)
64
KLONEŠANAS ZOOTEHNIKA Dzivnieku iegušanas
efektivitate
65
KLONEŠANAS ZOOTEHNIKA Dzivnieku iegušanas
efektivitate
66
KLONEŠANAS ZOOTEHNIKA Dzivnieku iegušanas
efektivitate
67
KLONEŠANAS ZOOTEHNIKA Dzivnieku iegušanas
efektivitate
68
TERAPEITISKA KLONEŠANA, IZMANTOJOT PIEAUGUŠAS
(SOMATISKAS) CILMES ŠUNAS UN AUDU INŽENIERIJU
69
Pieaugušas (somatiskas) cilmes šunas izplatitakai
s avots kaula smadzenes (bet ari ada, zarnu
epitelijs, zobu pulpa, aknas utt.)
70
Par pieaugušu cilmes šunu avotu var kalpot ari
citi audi un organi, piem., ada
Dr. J.Ancans, LU BF originala adas cilmes šunu
izdališanas metode
71
Audu inženierija apvieno terapeitisko klonešanu
un bioinženieriju, lai raditu biologiskas
aizstajejstrukturas, kuras atjaunotu, saglabatu
vai uzlabotu audu funkcijas.                     
  
www.innovitaresearch.org/ news/03122401.ht
72
Audu inženierija varianti. In vitro
73
Audu inženierija varianti. In vivo
74
Audu inženierija - shema
75
Audu inženierija piemeri
76
Audu inženierija piemeri
77
(No Transcript)
78
Audu inženierija piemeri
79
Audu inženierija piemeri
80
Audu inženierija piemeri
81
Experimental conversion of liver to
pancreas.Horb ME, Shen CN, Tosh D, Slack
JM.Curr Biol. 2003 Jan 2113(2)105-15. We
show that a modified form of Pdx1, carrying the
VP16 transcriptional activation domain, can cause
conversion of liver to pancreas, both in vivo and
in vitro.
82
(No Transcript)
83
(No Transcript)
84
LU Biotehnologijas inovaciju centrs, Kleisti
Divu eku rekonstrukcija ar Phare projekta
atbalstu terapeitiskas klonešanas un audu
inženierijas petijumu vajadzibam
85
P.Stradina KUS šunu transplantacijas
laboratorija, VM atbalstits projekts