VIRUSOLOGIJA

1
VIRUSOLOGIJA (VIRUSI UN ARPUSHROMOSOMU GENETISKIE
ELEMENTI)
PETIŠANAS METODES
2
IMUNOLOGISKAS METODES
Visparigs priekšstats par imunas aizsardzibas
sistemu un imunas atbildes veidošanos
3
Organisma imunitate (speja atškirt savejo no
sveša, svešo iznicinat)
Nespecifiska imunitate
Specifiska imunitate
4
Nespecifiskas imunitate
Nespecifiskas rezistences mehanismi
pH Lizocims u.c. enzimi Komplements Interfero
ns
1. Fiziskas barjeras 2. Biokimiskas
barjeras 3. Biologiskas barjeras
Akutas fazes reakcija Fagocitoze, Mikroflora
5
Virusu inficetie leikociti izstrada specialu
nelielu (17 kD) olbaltumvielu - interferonu
maisijumu, kas padara citas šunas neuznemigas
pret virusu uzbrukumu
6
Komplements
Ap 20 asins plazmas proteinu komplekss (5 asins
plazmas proteinu masas), kas aktiveta veida
izraisa dažadu šunu lizešanu
7
www.uic.edu/.../bios100/lecturesf04am/lect23.htm
8
Iekaisuma (akutas fazes) reakcija
Komplementa aktivešana izraisa ari neitrofilu
migrešanu un infekcijas vietu
9
Iekaisuma (akutas fazes) reakcija
10
IMUNOLOGIJAS PAMATLICEJI
Paul Ehrich ???? ???????? (1854. -
1915.) (1845. - 1916.) Humorala un šunu
imunitate, imunologijas sakums NP
- 1908.g.
11
Galvenie imunas sistemas organi Sarkanas kaulu
smadzenes (mieloida sistema) Liesa Timuss Limfmez
gli embrionalie (germinalie) centri (limfoida
sistema)
Galvenas imunas šunas Retikuloendotelialas
sistemas šunas (mononuklearie fagociti) Limfociti
12
(No Transcript)
13
Fagocitoze
Opsonizacija bakteriju un citu šunu fagocitozes
atvieglošana, piesaistot to virsmai asins seruma
proteinus vai citas makromolekulas, piem.
polisaharidus
14
FAGOCITOZES PROCESS
15
FAGOCITOZES POSMI

1. Bakteriju piesaistišanas pie membranu
   pseidopodijam
2. Bakteriju ieslegšana fagosoma
3. Fagosomas un lizosomas saplušana
4. Bakteriju noardišana
5. Atkritumu izvadišana

Oksidativais (elpošanas) spradziens
16
Oksidativais (elpošanas) spradziens
TNF (audzeju nekrozes faktora) un fMLPR (
formilpeptidu) recoptori dod signalu fagocitiskas
oksidazes (Phox, NADPH oksidazes) kompleksam, kas
veido aktiva skabekla (O2-) jonus
17
IMUNOLOGIJAS PAMATLICEJI
Jules Bordet (1870.-1961.) Antivielas,
komplements NP - 1919.g.
18
Organisma imunitate (speja atškirt savejo no
sveša, svešo iznicinat)
Nespecifiska imunitate
Specifiska imunitate
Komplements
Fagocitoze
Šunu imunitate
Humorala (seruma) imunitate
19
(No Transcript)
20
Humorala imunitate
Imunoglobulinu relativais izmers
21
Humorala imunitate
ANTIVIELAS
Imunoglobulinu struktura
22
Humorala imunitate
ANTIVIELAS
Imunoglobulinu struktura (IgG)
23
Humorala imunitate
ANTIVIELAS
Imunoglobulini
24
Humorala imunitate
Antigena un antivielas mijiedarbiba škiduma
ANTIGENS
Antigeni - proteini, polosaharidi, nukleinskabes,
to kompleksi. Imunogenitate
25
Humorala imunitate
HAPTENS
Neliela molekula, kas spej izraisit antivielu
veidošanos tad, ja piesaistita polimerai
strukturai
Digitoksigenins
26
IMUNOLOGIJAS KLASIKI
Nils Jerne (1911.-1994.) Antivielu
producejošo šunu klonalas selekcijas teorija
NP - 1984.g.
Frenks M. Burne (1899.-1985.) Imuna
tolerance, antivielu producejošo šunu klonalas
selekcijas teorija NP - 1960.g.
27
KLONALAS SELEKCIJAS TEORIJA
Lai veidotos specifiska imuna atbilde, antigenu
(Ag) jaatpazist. Ag atpazišana notiek tam
saistoties ar ipašiem receptoriem. Ag atpazišana
ir saistita ar starpšunu mijiedarbibu. Starpšunu
mijiedarbibu kontrole saistišanas ar MHC (Major
Histocompatibility Complex) proteiniem
-receptoriem
28
KLONALAS SELEKCIJAS TEORIJA
Katrs B limfocits nes viena tipa unikalu unikalu
antigena (Ag) receptoru Saskarsme ar molekulu,
kura spej stingri saistit receptoru izraisa
attieciga limfocita aktivaciju Diferencetas
efektoršunas, kuras rodas no aktiveta limfocita,
nes tadus pašus receptorus, ka sakotnejais
limfocits. Limfociti, kuri nes receptorus pret
paša organisma molekulam, tiek iznicinati to
agrinas attistibas stadijas
29
Humorala imunitate klonalas selekcijas teorija
Katrs limfocits nes vienu unikalu receptoru
antivielas priekšteci, kas radies imunoglobulinu
genu rekombinacijas un splaisinga
rezultata. Iespejamas pavisam7500 (150 V geni x
5 J geni un ap 10 variantu ka savienot V un J)
imunoglobulinu vieglas kedes variantu2,4
miljonu (80 V geni x 50 D geni x 6 J geni un ap
100 savienošanas versiju) smagas kedes
variantu. Antivielu iespejama daudzveidiba 7500
x 2 400 000 18 miljardi variantu
30
(No Transcript)
31
Humorala imunitate klonalas selekcijas teorija
32
Humorala imunitate
ANTIGENA PREZENTACIJA
MHC II struktura
33
Humorala imunitate
34
Humorala imunitate
35
Humorala imunitate
ANTIVIELAS
Imunoglobulinu tipi
36
Humoralas imunitates veidošanas
37
Humoralas imunitates veidošanas
Adjuvanti vielas, kas pastiprina antivielu
veidošanos pret citiem antigeniem
Freinda adjuvants BCG (Bacillus Calmet -
Gerain) Lanolinella
38
www.uic.edu/.../bios100/lecturesf04am/lect23.htm
39
Antivielu veidotos imunos kompleksus jaiznicina
Komplementa aktivacijas klasiskais celš
kompleksa proteini izveido kanalus ar
imunoglobuliniem (antivielam) iezimetu šunu
apvalkos / membranas. Šunas iet boja.
40
Komplements
41
Komplements
42
Antigenu un antivielu mijiedarbiba
Precipitacija
43
Antigenu un antivielu mijiedarbiba
Precipitacija
44
Antigenu un antivielu mijiedarbiba
Precipitacija
45
Antigenu un antivielu mijiedarbiba
Precipitacija
46
Antigenu un antivielu mijiedarbiba
Precipitacija
Dubulta radiala imunodifuzija pec Ohterlouni
http//upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/f/f
0/Ouchterlony_Double_Diffusion.JPG/18
47
Antigenu un antivielu mijiedarbiba
Precipitacija
Dubulta radiala imunodifuzija pec Ohterlouni
48
Antigenu un antivielu mijiedarbiba
Precipitacija
Dubulta radiala imunodifuzija pec Ohterlouni
49
Virusu un antivielu mijiedarbiba
Neitralizacija
50
Antigenu un antivielu mijiedarbiba
Aglutinacija
51
Virusu un eritrocitu mijiedarbiba
Hemaglutinacija
52
Virusu un eritrocitu mijiedarbiba
Hemaglutinacija
53
Virusu un eritrocitu mijiedarbiba antivielu
klatbutne
Hemaglutinacijas inhibicija
54
Virusu un eritrocitu mijiedarbiba
Hemadsorbcija
55
Komplementa atkarigas hemolizes reakcijas
56
Komplementa atkarigas hemolizes reakcijas
57
Virusu un modificetu antivielu mijiedarbiba
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme
immuno assay (EIA)
Imobilizeti reakcijas komponenti
Vairakkartigas mijiedarbibas (desmaizes princips)
Modificetas (konjugetas) antivielas
58
Avidina (streptavidina, neiravidina) / biotina
mijiedarbiba
Biotins (vitamins H)Avidins (proteins) ar 4
biotina saistibas vietam
Signala amplifikacija biotina/avidina mijiedarbiba
http//www.vectorlabs.com/data/descriptions/images
/descr_970_Page7.gif
59
Avidina / biotina mijiedarbiba
http//www.vectorlabs.com/data/descriptions/images
/descr_970_Page7.gif
60
Virusu un modificetu antivielu mijiedarbiba
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme
immuno assay (EIA)
E - sarmaina fosfataze S - p-nitrofenilfosfats
61
Virusu un modificetu antivielu mijiedarbiba
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme
immuno assay (EIA)
E - sarmaina fosfataze S - p-nitrofenilfosfats
62
Virusu un modificetu antivielu mijiedarbiba
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme
immuno assay (EIA)
E - sarmaina fosfataze S - p-nitrofenilfosfats
63
Virusu un modificetu antivielu mijiedarbiba
Radio-immuno assay (RIA)
64
Virusu un modificetu antivielu mijiedarbiba
Imuncitokimija un imunhistokimija Tieša un
netieša imunofluorescence
Staphylococcus aureus A proteins
65
Histologija un imunhistokimija
Histopathologic changes associated with rabies
encephalitis by HematoxillineEosine stain. Negri
bodies are cellular inclusions found in the
pyramidal cells of Ammon's horn, and the Purkinje
cells of the cerebellum. http//aapredbook.aappubl
ications.org/site/week/107_11.jpg
A rabies-infected neuronal cell with
intracytoplasmic inclusions. The red stain
indicates areas of rabies viral antigen by using
IHC or avidin-biotin complex technique. http//www
.cdc.gov/rabies/images/infected_neuronal.jpg
66
Imuncitokimija un imunhistokimija Tieša un
netieša imunofluorescence
BK virusa imuncitokimiska krasošana hemoragiska
cistita pacienta urina šunas
Zairas Ebolas virusa antigena imuncitokimiska
krasošana inficetas cukas plaušu šunas
http//cid.oxfordjournals.org/content/35/3/326/F3.
medium.gif
http//jid.oxfordjournals.org/content/early/2011/0
5/12/infdis.jir077/F3.medium.gif
67
Virusu proteinu un modificetu antivielu
mijiedarbiba
Western blot
1. Elektroparnese uz membranu filtra 2.
Blokešanas reakcija 3. Apstrade ar
virusspecifiskam antivielam 4. Apstrade ar
konjugetam, sugasspecifiskam antivielam 5.
Attistišana
68
Virusu nukleinskabju un modificetu antivielu
mijiedarbiba
Hibrida saistišana
69
Virusu nukleinskabju un modificetu antivielu
mijiedarbiba
Hibrida saistišana
70
Organisma imunitate (speja atškirt savejo no
sveša, svešo iznicinat)
Nespecifiska imunitate
Specifiska imunitate
Šunu imunitate
Humorala (seruma) imunitate
71
IMUNOLOGIJAS KLASIKI
Peter Doherty (1940.) Rolf
Zinkernagel (1944.) Šunu imunitates mehanisms
1975. g., NP - 1996.g.
72
Šunu imunitate
73
Šunu imunitate
ANTIGENA PREZENTACIJA
MHC I struktura
74
IZŠKIROŠAIS EKSPERIMENTS
75
No peles izole T-citotoksiskas šunas un audze tas
kopa ar dažadu virusu inficetam šunam no dažadam
pelu linijam
Pelu linija B Viruss X reakcijas nav
76
No peles izole T-citotoksiskas šunas un audze tas
kopa ar dažadu virusu inficetam šunam no dažadam
pelu linijam
Pelu linija A Viruss Y reakcijas nav
77
No peles izole T-citotoksiskas šunas un audze tas
kopa ar dažadu virusu inficetam šunam no dažadam
pelu linijam
Pelu linija A Viruss X reakcija ir
78
(No Transcript)
79
Apkopojot imuno atbildi veidojošo šunu funkcijas
80
Apkopojot imuna atbilde uz dažadiem patogeniem
81
IMUNOLOGIJAS KLASIKI
Cesar Milstein (1927.) Georges Koehler
(1944. - 1995.) Monoklonalo antivielu iegušanas
metode 1975. g., NP - 1984.g.
82
Monoklonalu antivielu iegušana
1976., Koehler G., Milstein C. Limfocitu un
mielomas šunu hibridi produce Av, kas ir
specifiskas vienam epitopam
83
Monoklonalas antivielas veidojošu hibridomu
iegušana
HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) barotne
TK un HGPRT pozitivas šunas
Aminopterins
84
Monoklonalu antivielu izmantošana šunu
diferencešanas pazimju noteikšanai
FACS - Fluorescence activated (assisted) cell
sorting
85
FACS tehnologija
86
FACS tehnologija
87
FACS tehnologijas izmantošana
o Izskaitit dalinas suspensija o Noteikt
biologisku materialu no nebiologiska o
Atdalit/noteikt dzivas un nedzivas dalinas o
Izvertet no 105 - 106 dalinas viena minute o
Nomerit dalinu strukturetibu, to
autofluorescenci, ka ari sekundaro fluorescenci o
Sortet atseviškas dalinas turpmakam analizem
88
FACS tehnologijas attistiba pirmie aparati
89
FACS tehnologijas attistiba modernie aparati
90
Luminex tehnologija
5,6 mm diametra lodites (mikrosferas) iekraso 100
atškirigos tonos (10 unikalas sarkanas x 10
unikalas infrasarkanas krasas koncentracijas).
Katru iekrasoto mikrosferu grupu parklaj ar sava
veida antivielam. Analizatora ar lazeriem
identifice katru mikrosferu grupu un, ja
antiviela piesaistijusi antigenu, tad ari
papildus piesaistito sekundaro krasvielu. Katras
mikrosferu grupas merijumus vairakkartigi
atkarto, viena parauga iespejams vienlaikus, atri
un precizi kvantitativi identificet lidz 100
dažadus proteinus.
91
Luminex tehnologija
http//www.panomics.com/index.php?idproduct_96 ht
tp//www.gamidor.com/company.asp?CompanyID23 http
//4.bp.blogspot.com/__AuwUApfRb4/S2dn-H6qviI/AAAA
AAAAGSA/d2FfbxzIE_I/s400/luminex.jpg