Clonagem G

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• Clonagem Gênica
• 1-Introduçao
• 2-Estratégia geral de clonagem gênica
• 3-Clonagem gênica
• 4-Vetores de clonagem plasmidial
• 5-Isolamento de gene por PCR
• Edmar Vaz de Andrade

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1-Introduçao
Tecnologia do DNA recombinante (TDR) conjunto de
técnicas que permite o isolamento de fragmentos
gênicos.
DNA recombinante
Multiplicação do DNA recombinante em uma célula
hospedeira
Isolamento e estudos para a caracterização do
fragmento de DNA purificado (gene isolado)
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1-Introduçao
Tecnologia do DNA recombinante (TDR) conjunto de
técnicas que permite o isolamento de fragmentos
gênicos.
Relevância possibilita o isolamento e
multiplicação de genes in vitro para posterior
análise/caracterização
Duas importantes classes de enzimas Endonucleases
de restrição (Tipo II) DNA ligase
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2-Estratégia geral de clonagem gênica
1-isolamento de um fragmento de DNA 2-Inserção
em um vetor de escolha (DNA recombinante ou
quimera) 3-Transporte para o interior de uma
célula hospedeira (transformação) 4-Seleçao de
células transformantes (OGM) 5-Replicação da
molécula de DNA recombinante 6-Multiplicação de
células, cada uma contendo cópias do mesmo
plasmídio recombinante (clones)
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3-Clonagem gênica
Clivagem do DNA pela enzima de restrição
EcoRI Extremidades Coesivas
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3-Clonagem gênica
Isolamento de fragmento gênico com enzimas de
restrição tipo II
Ligação de fragmentos isolados a um vetor de
clonagem pela DNA ligase
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4-Vetor de Clonagem Plasmidial
Componentes básicos de vetor plasmidial de
clonagem
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4-Vetor de Clonagem Plasmidial
1-Origem de replicação em E. coli (10 a 20 cópias
do plasmídio por célula) 2-Genes que conferem
resistência a antibióticos 3-Sítios únicos para
diferentes endonucleases de restrição
pBR322 plasmídio para clonagem em Escherichia
coli (1977)
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5-Isolamento de gene por PCR
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5-Isolamento de gene por PCR
Clonagem do gene de phuA