MARCADORES MOLECULARES BASEADOS EM DNA

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MARCADORES MOLECULARES BASEADOS EM DNA
Alberto José Prioli Sônia Maria Alves Pinto
Prioli Nupélia - Universidade Estadual de Maringá
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Marcadores Moleculares
RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP
DNA mitocondrial
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Marcadores Moleculares
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Marcadores Moleculares
RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP
? Custo Haplóide Alto No Cópias Herança
Materna Não Recombina Evolução Rápida
DNA mitocondrial
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COMO OBTER ESTES MARCADORES MOLECULARES ?
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• DNA Estrutura e Replicação
• A seqüência de bases codifica a
• informação genética.
• Com um molde e um primer a
• DNA polimerase sintetiza um
• novo polinucleotídeo.
• A necessidade de um primer per-
• mite a síntese in vitro (PCR) de
• fragmentos de interesse.

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PCR Reação da Polimerase em Cadeia

• Taq-polimerase
• dNTP
• Mg2
• Tampão
• Primers
• DNA
• Ciclos com mudanças
• de temperatura

A repetição d o ciclo amplifica o o número
de cópias do segmento entre os sítios do par de
primers. O resultado é lido em gel.
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Hot springs -Yellowstone National Park -USA
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A picture of the bacteria
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• PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Mullis Faloona, 1987 Saiki et al., 1985.
• Eficiência na detecção de polimorfismo.
• Síntese enzimática de milhões de cópias na
  presença da DNA pol.
• Reação anelamento e extensão com um par de
  primers
• sintetizados artificialmente.
• 
  CICLO
• Desnaturação
  Anelamento Extensão

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RAPD Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso

• Técnica desenvolvida por Williams et al.
  (1990).
• Primer curto e arbitrário. Não se sabe,
  antecipadamente, em
• em quais posições do genoma ocorrerão
  pareamentos.
• A amplificação é garantida por sítios de
  iniciação próximos e
• em fitas opostas.
• Cada fragmento amplificado é uma
  característica binária
• do indivíduo ou da população.
• Vantagens principais baixo custo, grande
  número de
• locos e não há necessidade de qualquer
  conhecimento
• prévio do genoma do organismo.

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Loco RAPD é um segmento amplificável, incluindo
os dois sítios de iniciação.
Cada loco pode ser tratado como um sistema de
DOIS ALELOS A configuração do segmento que
resulta em amplificação é o ALELO DOMINANTE A
configuração que não amplifica é o ALELO
RECESSIVO (nulo)
A INFORMAÇÃO OCULTA PELA DOMINÂNCIA É
PERDIDA não há como saber se a população está
em equilíbrio de HW, pois os heterozigotos
não podem ser identificados.
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Marcadores RAPD
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Parâmetros desenvolvidos para marcadores
co-dominantes podem ser estimados com
RAPD, admitindo-se equilíbrio de Hardy-Weinberg.

• Exemplos
• Distâncias genéticas
• Índice de fixação FST (diferenciação genética)
• Número de migrantes (Nm)
• ...

Para amostras pequenas, a metodologia de Lynch e
Milligan (1994) miniminiza o erro introduzido
pela suposição de equilíbrio.
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• Nem sempre é necessária a suposição de
  equilíbrio.
• Índices de similaridade (Jaccard ou outro)
• Coordenadas principais
• Componentes principais
• Componentes de variância da AMOVA
• Diversidade de Shannon
• . . .
• Estas análises não protegem contra a perda
• da informação oculta pela dominância.

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Usar RAPD? Se para a espécie
ainda não existem marcadores mais
eficientes, decide-se diante da
relevância e urgência.
O RAPD gera estimativas menos precisas, mas é
muito útil como ferramenta exploratória e em
combinação com marcadores mais informativos.
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Marcadores Moleculares
RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP
? Custo Haplóide Alto No Cópias Herança
Materna Não Recombina Evolução Rápida
DNA mitocondrial
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Marcadores Moleculares Mitocondriais

• Metodologia
• Escolha da Seqüência (Qual é o Objetivo?)
• DNA Total
• Amplificação via PCR
• Clonagem do Fragmento
• Seqüenciamento
• Seqüência Edição e Alinhamento

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• mtDNA
• Geralmente evolui 5-10 vezes mais rápido do que
  
• genes nucleares de cópia simples.
• Alta velocidade de evolução - No Transição gt
  Transversão
• CO I, II, III e Citocromo b Evolução
  lenta (conservados)
• ND, ATPases Evolução menos lenta (menos
  conservados)
• tRNAs Evolução lenta pequenos (59-75 bp)
  (primers)
• rRNAs Evolução lenta (interessantes p/
  espécies distantes)
• D-Loop ou Região Controle Mais variável do
  mtDNA.

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FRAGMENTOS D-loop DE 450 pb de Astyanax (lambari)
600 pb
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ELETROFEROGRAMA (EDIÇÃO NO COMPUTADOR) Picos com
as cores correspondentes a cada nucleotídeo.
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OBTENÇÃO DE INFORMAÇÕES ECOLÓGICAS COM MARCADORES MOLECULARES
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Molecular Markers and Genetic Variability of
Hoplias aff. malabaricus Populations from the
Floodplain of Upper Paraná River PRIOLI1,2,
Alberto J. LUCIO1, Léia C. MANIGLIA1, Thiago
C. PRIOLI1,2, Sônia M. A. P. JÚLIO Jr1,2,
Horácio F. PAZZA1, Rubens PRIOLI1,3, Laudenir
M. 1Nupélia Núcleo de Pesquisas em
Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura 2Depto.
Biol. Celular e Genética 3Depto. Biologia
Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo,
5790, 87020-900 Maringá, PR, Brazil. Autor para
correspondência (Phone [phone] Fax
44-263-1424 e-mail ajprioli_at_nupelia.uem.br)
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Planície de inundação do alto rio Paraná
Base Nupelia-UEM em Porto Rico - PR
Sete Quedas
Reservatório de Itaipu
Foz do Iguaçu
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Planície de inundação do alto rio Paraná
Base Nupelia-UEM em Porto Rico - PR
Sete Quedas
Reservatório de Itaipu
Foz do Iguaçu
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Atualmente ocorrem três citótipos de Hoplias
aff. malabaricus na planície alagável do alto
rio Paraná A (42) C (40) D (39/40)
macho/fêmea O citótipo C invadiu a planície
depois do barramento de Itaipu.
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Figure 1  DNA fragments amplified by PCR with
SPAR primer (GGAC)3T, identifying Hoplias aff.
malabaricus cytotypes A, C, and D from the
floodplain of Upper Paraná River. (L) Molecular
weight markers (Ladder 100 bp) (b) negative
control without DNA.
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Dados sobre Citótipo C na planície Conclusão
Figure 2. Neighbor-joining tree for mitochondrial
control region sequences of Hoplias malabaricus
specimens from the Upper Paraná River Foodplain.
Genetic distance was computed by using Tamura and
Nei (1993) method. Number on each node indicates
bootstrap probability based on 1000 replications.
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O monitoramento com ISSR evidenciou que o grupo C
é o mais freqüente na planície, nos ambientes
lóticos, semi-lóticos e lênticos.