Geneticka osnova i molekularna dijagnostika mi

1
Geneticka osnova i molekularna dijagnostika
mišicnih distrofija
Doc. dr. Emina Kiseljakovic specijalista
medicinske biohemije Laboratorij za molekularnu
medicinu Medicinski fakultet u Sarajevu

2
Duchenne i Becker-ova mišicna distrofija (DMD i
BMD)

• genski defekti na najvecem genu (79 egzona, 2.5
  Mbp) lociranom na kratkom kraku Xp21.1 hromozoma,
  gen kodira distrofin (427kDa).
• Geneticke karakteristike kod najveceg broja
  pacijenata u genu za distrofin se nadu delecije
  ili duplikacije jednog ili više egzona. Mogu se
  naci tackaste mutacije i male delecije i
  insercije.
• Fenotipske karakteristike teški oblik DMD - rano
  javljanje, progresivna bolest, visoke vrij.
  kreatinina u serumu i gotovo potpuno odsustvo
  (lt2) distrofina u mišicnim celijama.
• Blagi oblik BMD detektira se distrofin,
  fenotipski se javlja protein sa poremecenom
  slabijom funkcijom i velicinom.

3
DMD tipovi mutacija
60-65
25-35
5-10
BMD - do 85
4
Delecije na genu za distrofin
tzv.hot spots mjesta pokrivaju 98 svih
delecija.
BMD
Intermed.
DMD
3'
5'
Egzoni
Najcešca delecija DMD je out-of-frame delecija
egzona 45
5
Duplikacije na genu za distrofin
Distribucija duplikacija na genu za distrofin.
Oko 80 duplikacija je smješteno na 5 kraju, a
oko 20 u centralnoj regiji gena.
J Mol Diagn. 2005 7(3) 317326.
6
Male mutacije na genu za distrofin
Distribucija malih mutacija (tackaste mutacije,
male delecije i duplikacije na genu za distrofin.
Nasumican raspored duž cijelog gena.
J Mol Diagn. 2005  7(3) 317326.
7
Promjena okvira citanja i prijevremeno prekidanje
translacije out of frame mutacija kod DMD.
8
Molekularna dijagnostika DMD gena

• Minimalni nivo dijagnostickog testiranja -
  skrining vecine delecija egzona. Bazicna metoda
  je mutliplex PCR . Ovom metodom se otkrivaju
  najcešce delecije.
• Prednost metode, relativna jednostavnost, ali ne
  otkriva velike duplikacije, male delecije ili
  insercije, tackaste mutacije niti se može
  kosititi za testiranje žena nosioca.
• Negativan test ne iskljucuje dijagnozu DMD ili
  BMD, obzirom da 15-35 mutacija nisu delecije
• Za identifikaciju duplikacija (5 pacijenata)
  ili za dalju karakterizaciju delecija koristi se
  kvantitativni multipleks PCR.
  for -prajmeri su fluorescentno obilježeni -
  automatski sekvencer vrši detekciju i
  kvantifikaciju PCR produkata. Napokon za dalju
  identifikaciju mutacije gena se koristi Southern
  blot analiza.

9
Molekularna dijagnostika DMD gena
Southern blot direktna detekcija delecija i
duplikacija. Dijagnoza, detekcija nositelja,
genetsko savjetovanje Ako nije otkrivena delecija
ili duplikacija kod pacijenata treba uraditi
sekvenciranje.

• MLPA multiplex ligation-dependent probe
  amplification - kvantitativna analiza delecija i
  duplikacija svih egzona
• array-CGH oligonucleotide-based array
  comparative genomic hybridisation - analiza broja
  kopija varijacija cijelog gena.
• 2 slucajeva sa kompleksnim rearanžmanima i
  dubokim intronskim promjenama koje se ne
  detektiraju analizom genomske DNA

J Mol Diagn. 2005 7(3) 317326.
10
Miotona mišicna distrofija

• Miotona distrofija tip 1 - mutacije na
  DMPK (distrofija miotonika-protein kinaza) genu,
  dok tip 2 - mutacije na CNBP genu. Protein koji
  kodira DMPK gen igra ulogu u komunikaciji celija.
  Protein koji kodira CNBP gen (srce i skeletna
  muskulatura) pomaže regulaciju funkcija drugih
  gena.
• MD nastaje zbog abnormalnog ponavljanja segmenta
  DNA, nastaje nestabilna regija gena, mutirani gen
  stvara velike kolicine mRNA -abnormalno duga mRNA
  formira ugruške koji interferiraju sa drugim
  proteinima.

3 regija na 19q13
11
Miotona mišicna distrofija

• CNBP (ZnF9) ponavljanje CCTG tetranukleotid
  sekvence u prvom intronu 3q21. Fiziološki manje
  od 26 puta, oboljeli imaju 75 11000 puta
  ponovke.
• Miotona distrofija tip 1 (DM1) 
• za detekciju ekspanzije trinukleotidni ponovaka
  do 125 CTG ponovaka - PCR (fluorescentno
  obilježeni prajmeri kapilarna elektroforeza)
• dugacki ponovci se analiziraju Triplet-repeat
  Primed PCR ili Southern blotting za odredivanje
  velicine ponovaka
• Kvantitativni RT-PCR da odredivanje nivoa mRNA
  DMPK gena u mišicnoj biopsiji
• Miotona distrofija tip 2 (DM2) 
• Dugacki ponovci Quadruplet-repeat Primed PCR ili
  Southern blotting genomske DNA za odredivanje
  velicine ponovaka

12
Facioskapulohumeralna mišicna distrofija

• U oko 95 slucajeva FSHD je uzrokovana
  heterozigotnom parcijalnom delecijom kritickog
  broja repetitivnih elemenata (D4Z4) na hromozomu
  4q35 (FSHD1). U oko 5 bolesnika sa FSHD, nije
  utvrdena redukcija D4Z4 ponavljanja - FSHD2. Oni
  pokazuju gubitak DNA metilacije i
  heterohromatinske markere, slicno kao kod FSHD1.

www.jcb.org/cgi/doi/10.1083/jcb.201007028
13
Facioskapulohumeralna mišicna distrofija

• Parcijalna delecija D4Z4 ima za posljedicu
  promjenu hromatina i gubitak odgovarajuce
  kontrole genske ekspresije.
• Molekularni rearanžman uzrokuje varijaciju broja
  kopija ponovaka mikrosatelita nazvanog D4Z4,
  velicine 3.3 kbp, koji je izuzetno polimorfican i
  varira od 11-150 kopija. Broj preostalih ponovaka
  je povezan sa životnom dobi pojave simptoma,
  težinom bolesti i progresijom
• vece delecije - teža slika FSHD
• Southern blot analiza za utvrdivanje broja
  ponovaka
• Prenatalno i preimplantacijsko testiranje

14
Udno-pojasna mišicna distrofijaLimb-gridle
muscular dystrophy (LGMD)
Molekularna dijagostika je kompleksna jer je
genotipski i fenotipski heterogena.
Identifikovano je 23 LGMD gena 15 je u vezi sa
autosomno recesivnim naslijedivanjem.
Limb-girdle MD, tip 2D (LGMD2D)Molekularno
testiranje a-sarcoglycan (SGCA)PCR detekcija
tackaste mutacije (c.229CgtT) Limb-girdle MD, tip
2E (LGMD2E) Molekularno testiranje ß-sarcoglycan
(SGCB) PCR detekcija tackaste mutacije
(c.341CgtT) Limb-girdle MD, tip 2I (LGMD2I)
Molekularno testiranje fukutin-related protein
(FKRP) PCR detekcija tackaste mutacije
(c.826CgtA) Ostale se mogu dijagnosticirati
direktno sekvenciranjem, najcešca je Limb-girdle
MD, tip 2A (LGMD2A) Molekularno testiranje
calpain-3 (CAPN3)

• Analiza genomske DNA PCR-ARMS, RFLP-PCR,
  Southern blot
• Biopsija mišica RNA i Western blot.