KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODRE

1
KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODREÐIVANJE
MONOKLONSKOG PROTEINA U MM I SRODNIM POREMECAJIMA
kako koristiti metode i interpretirati nalaze

• Danica Matišic

2
DIJAGNOZA MULTIPLOG MIJELOMA OSNIVA SE NA NALAZU
KLASICNOG TRIJASA

• NALAZU MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA U SERUMU I/ILI
  URINU
• INFILTRACIJE KOŠTANE SRŽI PLAZMA STANICAMA (gt10)
• OSTEOLITICKIH ŽARIŠTA
• IMUNOKEMIJSKU METODU ZA ODREÐIVANJE
• RAZREDA I TIPA MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA,
• PRVI PUT OPISALI SU GRABAR I WILLIAMS 1953.GOD.

3
LABORATORIJSKA EVALUACIJA MONOKLONSKOG PROTEINA
Robert A, Kyle, David F. Keren,Raymond
Alexanian,Usha Kallemuchikkal

• 1. Elektroforeza proteina u serumu i urinu
• nisko rezolutne elektroforeze
• visoko rezolutne elektroforeze
• 2. Kvantitativno odredivanje imunoglobulina
• Nefelometrijski ili turbidimetrijski
• Radijalna imunodifuzija
• 3. Definiranje razreda i tipa monoklonskog
  imunoglobulina
• Imunofiksacija
• Imunoelektroforeza
• Imunoselekcija
• Imunosupstrakcija moguca samo uz kapilarnu
  elektroforezu
• 4. Kvantitativno odredivanje monoklonske
  komponente
• Denzitometrijski
• 5. Kontrola kvalitete evaluacije monoklonskog
  proteina
• Kljucna komponenta interne kontrole direktan
  kontakt biokemicara s klinicarem o slucaju koji
  je neuobicajene prirode ili ako postoji bilo koja
  diskrepansa u nalazu

4
NACIONALNA GRUPA ZA LIJECENJE HEMATOLOŠKIH
BOLESTI Pododbor za laboratorijsku hematologiju i
morfologiju IMUNOKEMIJA D. Matišic, V.
Preden-Kerekovic
DIJAGNOSTICKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU
MONOKLONSKOG PROTEINA (M-P)
5
Elektroforeza serumskih proteina može se izvesti
nisko i visoko rezolucijskim tehnikama

• 1. Elektroforeza proteina u serumu i mokraci
  indicirana je za svakog bolesnika kod kojeg
  postoji sumnja na poremecaj plazma stanica.

Nisko rezolucijske elektroforezeelektroforeza
na acetat-celulozi ili agarozi razdvaja proteine
na pet frakcija. Kod ove tehnike nije moguce
postici dobro razdvajanje ß1-(transferin) i
ß2-globulinske frakcije (C3) Visoko
rezolucijske elektroforezekapilarna zonska
elektroforeza omogucuje bolje razdvajanje
transferina i C3 u ? podrucju kao i bolje
uocavanje niskih koncentracija M-proteina koji
mogu putovati od ?2 do gama podrucja
6
NISKO REZOLUCIJSKA ELEKTROFOREZA SERUMSKIH
PROTEINA
1.Procjena približne koncentracije glavnih
serumskih proteina alb, alfa-1-AT,Hp, alfa-2-M,
C3, Tf, IgA i IgG 2.Detekcija monoklonskog
proteina 3.Osjetljivost detekcije monoklonskog
proteina je 2 g/L na acetat-celulozi i 1 g/L na
agarozi
7
VISOKO REZOLUCIJSKA ELEKTROFOREZA SERUMSKIH
PROTEINA KAPILARNA ZONSKA ELEKTROFOREZA

--
-

• Visoki stupanj rezolucije posljedica je više
  faktora
• primjena visokih napona (od 3-30 kV)
• kontrola temperature
• kontrola debljine sloja gela i
• sama aplikacija uzorka

8
Visoko rezolucijski sustavi omogucuju razdvajanje
proteina na 10 do 12 frakcija
prealbumin, albumin, ?-lipoprotein, a1-kiseli
glikoprotein (orozomukoid), a1-antitripsin, a2-
makroglobulin, haptoglobin, transferin,
?-lipoprotein, C3, fibrinogen, CRP (kad je
znacajno povišen) i ?-globulini koje uglavnom
predstavlja IgG.
9
Primjer CZE

• Figure 1. Electropherograms of a sample with an
  IgM monoclonal protein.
• (A), agarose electrophoresis (Hydragel 15 HR) on
  the Hydrasys system (Sebia) (B), capillary zone
  electrophoresis (Paragon 2000 Beckman-Coulter)
  (C), agarose electrophoresis (Hydragel 15 HR) on
  the Hydrasys system (Sebia) after mercaptoethanol
  treatment (10 µL of 110 dilution of
  mercaptoethanol added to 100 µL of serum). The
  fractions in panels A and C are albumin,
  1-antitrypsin, -lipoprotein, 2-macroglobulin
  and haptoglobin, ß-lipoprotein, transferrin, C3,
  and the -globulin fraction. The small deflection
  in the mid-gamma region is an artifact. The arrow
  indicates the monoclonal protein.

10
Vizualni pregled elektroforeze
Klinicka sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce
Bez promjena
Hp-Hb
Hb
CRP
Opisni nalaz klinicka informacija daju
tumacenje nalaza
Imunoelektroforeza i/ili imunofiksacija ili
imunosupstrakcija
11
2.Za definiranje razreda i tipa M-proteina
indicirana je imunoelektroforeza i/ili
imunofiksacija ili imunosupstrakcija koja je
moguca samo uz kapilarnu zonsku elektroforezu
anoda
katoda -
Heidelberger-Kendallova krivulja
12
-iako je nalaz elektroforeze negativan kod
suspektnih bolesnika treba naparaviti IF (IgD,
IgE)) -imunofiksacija nije indicirana ako se
ustvrdi poliklonska hipergamaglobulinemija
IMUNOELEKTROFOREZA
IMUNOFIKSACIJA
13
Metoda imunosupstrakcije
14
Imunoselekcija je imunokemijska tehnika kojom se
mogu dokazati monoklonski sintetizirani teški
lanci.

• U gelu agara, u koji su prethodno dodani
  antiserumi na vezane lake lance kapa i lambda
  tipa, elektroforetski se razdvoje proteini u
  serumu. Pri tom razdvajanju, dolazi do vezanja
  kompletnih molekula imunoglobulina, dok
  eventualno prisutni monoklonski slobodni teški
  lanci ostaju nevezani.
• U slijedecem koraku izvodi se imunokemijska
  reakcija precipitacije slobodnih teških lanaca sa
  specificnim antiserumom na ? (G), a (A) ili µ (M)
  teške lance.

15
3. M-protein je potrebno pratiti
denzitometrijski ali IF nije potrebno ponavljati
ako se nisudogodile promjene u migraciji
M-proteina ili ako se nije pojavila nova vrpca
1
2. Nefelometrijski izmjereni Ig G 26,3 g/L A
0,43 g/l M 0,35g/L Denzitometrijski
izmjereni IgG 29,4 g/L ?8,16g/L ?0,57g/L
?/?14,3 (? 1,7-3,7 ? 0,90-2,10 ?/?
1,35-2,65)
1
1
2
3
Alb
M-prot.
2
3
2. Nefelometrijski izmjereni Ig G 4,6 g/L A
14,9 g/L M 0,62 g/L Denzitometrijski
izmjereni IgA 19,1 g/L
16
4. Za sve bolesnike s poremecajem plazma
stanica potrebno je nefelometrijsko ili
turbidimetrijsko odredivanje Ig da bi se
ustvrdila koncentracija ostalih neukljucenih Ig
Nefelometrijski odredeni Ig G3,70 g/L A43,4
g/L M0,16g/L Denzitometrijski odreden
IgA36,7g/L
4
4. Nefelometrijski izmjereni Ig G 22,74
g/L A 0,14 g/l M 0,10 g/L
Denzitometrijski izmjer. G 21,4 g/L
4
17
5.Kod bolesnika s multiplim mijelomom,
Waldenström makroglobulinemijom i amiloidozom
potrebno je pratitipromjene u koncentraciji
M-proteina svakih 1-2 mj.dok je kod MGNZ
dovoljno je 1 x u godini
G 16,3 g/L
G 26,3 g/L
G 12,3 g/L
18
6. Hiperviskozni sindrom traži zamjenu plazme s
indikacijama utemeljenim na klinickim
znacajkama(viskozitet i elektroforezu seruma
treba napraviti prije nego se plazma
zamijeni,radi usporedbe koncentracija
M-proteina) Primjer elektroforeze bolesnika s
Waldenström m.prije (A) i poslije (B)
plazmafereze
A
B
19
7.Krioglobuline treba napraviti u svih bolesnika
s M-proteinom koji pokazuju osjetljivost na
hladnocu, posebno kod onih sa M-IgM.

20
kljucna komponenta interne laboratorijske
kontrole je izravan kontakt biokemicara i
klinicara o slucaju koji je neuobicajene prirode
ili ako postoji bilo kakav nesklad u nalazu.
8. Kontrola kvalitete laboratorijske evaluacije
M-proteina
21
Bence-Jones protein
9. Svim bolesnicima s multiplim mijelomom,
Waldenström makroglobulinemijom, amiloidozom i
srodnim bolestima potrebno je odrediti prisutnost
i dnevno izlucivanje BJP (IFnajmanje 100 x
ukoncentriranog urina)

• Monoklonski slobodni lagani lanci
  imunoglobulina, Bence-Jones proteini, (BJP), su
  homogena populacija, kapa (?) ili lambda (?)
  tipa, lakih lanaca imunoglobulina koje stvara
  maligni klon B-stanica.

22
Sinteza i metabolizam lakih lanaca
23
Bence-Jones protein
Prisutan protein BJ
Elektroforeza proteina u mokraci (najmanje 100 x
ukonc. uzorak)
Negativ. nalaz ako na elektroforetskoj slici
100x ugušcenog urina ne nalazimo nikakvu
suspektnu monoklonsku vrpcu
Preporuka je koristiti 24 satni urin
24
Identifikacija BJP imunofiksacijom ili
imunoelektroforezom

• Elf.prot.
• u serumu
• Elf.prot.
• u urinu
• IE

25
Serum Free Light Chain Assay in Diagnosis and
Monitoring of Multiple Myeloma
D.E. Smith, A.R. Bradwell, G.P. Mead, H.D.
Carr-Smith Article Archives 2005, Volume 16,
Number 1
Introduction A distinguishing feature of the
monoclonal gammopathies is the production of
homogeneous populations of immunoglobulins by
malignant clones of B-cells. Production of free
light chains (FLCs) is an important feature of
light chain diseases, such as light-chain myeloma
(LCMM), primary systemic (AL) amyloidosis, and
light-chain deposition disease (LCDD). However,
in a retrospective study of 745 archived samples
from patients with plasma cell disorders, 91 had
abnormal FLC levels, and 97 had either elevated
FLC levels or an abnormal ratio (see Table 1)
1-3. Among those patients with intact
immunoglobulin myeloma, 96 were found to have
either elevated FLC levels or an abnormal
ratio. Referentni intervali za slobodne lake
lance u serumu
26
FREELITE Serum Free Light Chain Assays
27
FREELITE Serum Free Light Chain Assays
28
B koncentracija lakih lanaca u serumu kod
zdravih ispitanika,bolesnika sa NSMM i MMLL kapa
i lambda tipa
A
B
Osjetljivost SPE
Osjetljivost IF
A koncentracija lakih lanaca u serumu kod
zdravih ispitanika,bubrežnih bolesnika i
bolesnika sa MMLL kapa i lambda tipa
29
Kristali Bence-Jones proteinaRazumijevanje
strukture kristala BJP moglo bi biti kljucno za
razvoj selektivne terapije lijekovima.
Microgravity Space is the laboratory of the next
millennium Mikrogravitacijski uvjeti u svemiru
su jedinstveni okoliš za istraživanja koja vode
novim produktima i tehnologijama.
STS-95
STS-80