TERRENO DI COLTURA

1
TERRENO DI COLTURA

• Miscela di composti biologici o sintetici,
  organici o minerali, capace di fornire un
  ambiente ottimale per la crescita di un
  particolare tipo di microrganismo

2
TERRENI DI COLTURA

• I microrganismi vivono in natura in popolazioni
  che sono dette miste, costituite da unampia
  varietà di differenti tipi di microbi. I
  microrganismi necessitano di ambienti favorevoli
  e di sostanze nutritive adatte. Il terreno di
  coltura deve contenere principi nutritivi
  essenziali per lo sviluppo di una coltura
  microbica e deve fornire condizioni ambientali
  adatte alla crescita, vale a dire condizioni
  ottimali di pH, pressione osmotica, ossigeno
  atmosferico,ecc.

3
TIPI DI TERRENI

• TERRENI COMPLESSI non si conosce la loro esatta
  composizione chimica sono i più comunemente
  usati x es. Brodo Comune, Brodo di Malto, MRS.
• TERRENI DEFINITI o SINTETICI si conosce lesatta
  composizione chimica formato da composti chimici
  puri, aggiunti a concentrazione nota.
• TERRENI SELETTIVI o DI ARRICCHIMENTO terreni di
  coltura aventi una combinazione di nutrienti che
  in combinazione con opportune condizioni fisiche
  permettono lisolamento di SPECIFICI
  microrganismi (x es. con luso di antibiotici)

4
TERRENI DI COLTURA

• Nutrient Broth
• Nutrient Agar
• peptone 5 g
• estratto di carne 1 g
• estratto di lievito 2 g
• sodio cloruro 5 g
• acqua dist. 1000 ml
• Sospendere i componenti in acqua dist. fredda
  poco a poco per evitare la formazione di grumi,
  agitare e portare all'ebollizione fino a completa
  soluzione. Aggiustare il pH fino a 7,4.
• Sterilizzare in autoclave.

5
X BATTERIX LIEVITI E MUFFE

• De Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI
• Peptone from casein 10.0g
• meat extract 8.0g
• yeast extract 4.0g
• D()-glucose 20.0g
• dipotassium hydrogen phosphate 2.0g
• Tween 80 1.0g
• di-ammonium hydrogen citrate 2.0g
• sodium acetate 5.0g
• magnesium sulfate 0.2g
• manganese sulfate 0.04g
• agar-agar (not present in MRS broth) 14.0g
• acqua dist. 1000 ml

6
TERRENI DI COLTURA

• LIQUIDI sono chiamati BRODI (BROTH)
• SOLIDI contengono AGAR.
• agar
• - È un polisaccaride contenente zolfo estratto da
  unalga
• marina. Reperibile in commercio in forma
  essiccata pura. Si disidrata facilmente. Ci sono
  vari tipi di agar che hanno proprietà fisiche
  diverse.
• - Non è un nutriente, ma utilizzato come agente
  solidificante
• nei terreni di coltura.
• Dal punto di vista chimico è un galattano,
  carboidrato complesso formato da molecole di
  galattosio.
• - Liquefazione a 97/100C solidificazione a 42/
  45C
• I terreni agarizzati possono essere incubati a
  tutte le temperature.
• Possono essere anche utilizzate gelatina o gel di
  silice

7
CRESCITA IN SUBSTRATI LIQUIDI

• Se il terreno è liquido la crescita può dar luogo
  a 1) Intorbidamento 2) Formazione di una
  pellicola 3) Sedimento (lievito) 4)Mucosità

8
INGLOBAMENTO O INCLUSIONE

• Il terreno viene seminato mentre è ancora liquido

9
I microrganismi ad occhi nudo crescita in
substrati liquidi
10
I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDOCRESCITA IN
SUBSTRATI SOLIDI ( SLANT)

• Lagar inclinato è una provetta di terreno a base
  di agar che viene posta obliqua durante il
  raffreddamento e si presta per essere seminata
  con lansa o con lago. Sono più facilmente
  osservabili le colture che producono pigmento

11
I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDOCRESCITA IN
SUBSTRATI SOLIDI (SLANT)
12
LA SEMINA DEI TERRENI DI COLTURA

• SEMINA DI TERRENO SOLIDO
• SPATOLAMENTO

13
STRISCIO
14
I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDOCRESCITA IN
SUBSTRATI SOLIDI (PIASTRE DI PETRI)

• Se si aggiunge una sostanza solidificante ad un
  brodo che contiene cellule batteriche, si
  verificherà che queste rimangono intrappolate
  ciascuna al proprio posto invece di galleggiare
  (terreno liquido) e , moltiplicandosi produrrano
  una massa visibile di cellule, detta COLONIA.

15
I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDOCRESCITA IN
SUBSTRATI SOLIDI (PIASTRE DI PETRI)

• Se le cellule si raggruppano ad una certa
  distanza, ciascuna sarà in grado di sopravvivere
  e genererà una colonia isolata. Colonie di
  microrganismi diversi differiscono per misura,
  colore e struttura.Per questo motivo laspetto di
  una colonia è importante per lidentificazione di
  una coltura.

16
I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDOCRESCITA IN
SUBSTRATI SOLIDI (PIASTRE DI PETRI)

• TECNICA DELLA STRISCIATA SU PIASTRA
• Si può trasferire una coltura microbica sulla
  superficie dellagar di una piastra petri con
  lansa o con lago incurvato questa tecnica
  viene chiamata di trasferimento per striscio ed
  una piastra così preparata viene detta
  strisciata. Esistono varie tecniche di striscio
  su piastra. Attenzione! Bisogna flambare e
• far lasciare raffreddare lago o lansa
• ad ogni passaggio.
• Lobiettivo della tecnica dello striscio
• è quella di formare da una sospensione di
• cellule,
• delle colonie ben separate.

17

• Allinizio di una striscio le cellule sono
  strettamente compatte, ma con il proseguire lo
  striscio le cellule rimangono sempre meno
  sullago, trasferendosi sempre più distanziate
  sullagar formando colonie sempre più separate.
• Poche strisciate frettolose non producono colonie
  separate una buona piastra è il risultato di
  molti movimenti continui dellansa o dellago. Si
  inizia con una goccia di coltura sul bordo della
  piastra.
• In una delle tecniche si sterilizza alla fiamma
  lago per lo striscio o lansa e si raffredda sul
  bordo dellagar. Si tiene sempre semicoperta la
  piastra di petri. La goccia deve essere opposta a
  voi e strisciate verso di voi

18
CONCETTO DI STERILITÀ

• STERILIZZAZIONE distruzione di ogni organismo
  vivente,
• (comprese le endospore di Bacillus e
  Clostridium).
• DEVE essere assoluta In un laboratorio di
  microbiologia. Nelle industrie alimentari è un
  concetto statistico (tempi di riduzione
  decimale).
• Il più usato ed efficace strumento per
  sterilizzare è il CALORE
• PERCHÉ? Perché le proteine denaturano
• Lo strumento principale di sterilizzazione in
  microbiologia è
• LAUTOCLAVE sterilizza attraverso il vapore
  sotto pressione
• (assai più efficace del CALORE secco)

19
LAUTOCLAVE

• sovrapressione di 1atm
• 121C
• tempo di 15 minuti
• il vapore deve poter entrare
• in contatto con le soluzioni
• (tappi di cotone bottiglie aperte)
• P/T minori e
• tempi maggiori per
• limitare il danno ai composti organici
• (imbrunimento, caramellizzazione)
• N.B. Molti zuccheri e
• gli antibiotici devono essere sterilizzati per
• filtrazione

20
LAVORARE IN STERILITÀ

• Pipette
• Ansa
• Spatola
• Becco Bunsen
• Si lavora con fiamma ossidante
• (azzurra, più calda, più stabile),
• NON riducente (gialla)

21

• Tutti i terreni di coltura dovrebbero essere
  controllati prima dell'uso per contaminazione e
  data di scadenza.
• Larea iniziale di semina deve ricoprire una
  superficie compresa fra un terzo ed un quarto
  dellarea complessiva dellagar utilizzato.
  Possono essere utilizzate in funzione delle
  circostanze piastre intere, a metà od a quattro
  settori. I campioni devono essere seminati per
  ottenere colonie isolate, o diffusi direttamente
  su un intera porzione di una piastra e posti ad
  incubare senza successiva diffusione del
  materiale.

22

• Le anse metalliche devono essere flambate
  portando la loro estremità nella parte inferiore
  della fiamma di un Bunsen fino a che lintera
  ansa non assume colore rosso per il calore.
  Riporle a raffreddare su un supporto prima del
  loro utilizzo. Ciò può essere eseguito prima e
  dopo il loro utilizzo e fra la semina di piastre
  di agar.
• E consuetudine utilizzare due anse per
  consentire un adeguato raffreddamento di ciascuna
  dopo la flambatura mentre si sta utilizzando
  laltra ansa. Possono essere utilizzate per
  ciascuna piastra anse monouso diverse. Le anse di
  metallo devono essere riscaldate con la fiamma di
  un Bunsen con la parte terminale dellansa
  rivolta verso basso fino ad arroventarsi, poi
  rimosse e lasciate raffreddare.
• Tutti i terreni devono essere incubati il più
  presto possibile. La piastre per lincubazione
  anaerobica devono essere incubate il più presto
  possibile per prevenire la perdita di vitalità

23
TECNICA ASETTICA

• Quando si manipolano campioni o culture, la
  tecnica asettica risulta importante per evitare
  la loro contaminazione e proteggere chi lavora da
  infezione proveniente dal campione.
• Se il lavoro viene svolto su un banco aperto, uno
  sterilizzatore Bunsen dovrebbe essere collocato
  in stretta prossimità per flambare le anse o i
  fili metallici.
• Quando si aprono i contenitori delle culture
  mantenere il campioni lontano dal viso

24
INCUBAZIONE DEI MICRORGANISMI

• I brodi o i terreni agarizzati seminati devono
  essere posti ad una
• TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI
  ottimali per
• permettere la crescita del microrganismo con sui
  si sta lavorando
• Esempi
• Bacillus stearothermophilus
• G, anaerobio facoltativo, termofilo
• Bifidobacterium bifidum
• G, anaerobio stretto, mesofilo
• Incubazione a 60C per 8-12 h Incubazione a 37C
  per 36-48 h
• Le piastre vanno incubate in posizione capovolta.
• Scrivere nome, data e tipo di contenuto