Un peu d'histoire:

1
Maladies génétiques

• Un peu d'histoire
• 1970 1ère greffe de moelle osseuse (GMO)
  pour 1 déficit immunitaire
• 1983 GMO non HLA identique (déplétion T)
• 1990 auto greffe de cellules souches
  périphériques
• 1998 sélection de cellules CD34

2
Traitement par cellule souche patient-spécifique
Développer des blastocytes in vitro
3
Moelle osseuse
Sang
Lymphocytes
T
NK
B
Polynucléaires
Cellule souche
Monocytes
Globules rouges
Plaquettes











4
Thérapie géniqueUn défi complexe

• Insérer le "bon gène" dans "les bonnes cellules"
  
• Niveau d'expression ni trop faible ni trop fort
• Obtenir une expression prolongée si
  nécessaire (ou régulée)
• Eviter la toxicité
• - mutagènèse insertionnelle
• - réaction inflammatoire dirigée contre le
  vecteur ou le produit du transgène

5
Thérapie génique des maladies héréditaires du
système hématopoïétique Points clé

• Identification du gène responsable
• Compréhension de la maladie pourquoi cette
  mutation donne ces signes cliniques
• Durée de vie des cellules transduites
• Profil dexpression
• Une protéine mutée mais présente peut
  contrecarrer leffet bénéfique du gène
  thérapeutique

6
Déficits immunitaires combinés sévères (DICS)
de bons modèles pour la thérapie génique

• Maladies léthales dont le traitement nest que
  partiellement satisfaisant
• Bases génétiques connues
• Le produit génique confère un avantage sélectif
  aux cellules des précurseurs lymphoïdes
  transduites
• Grande capacité de prolifération des cellules
  pro-T
• Les cellules T matures vivent longtemps ( gt
  années)

7
SCID diseases
NK
CD8
CLP
HSC
CD4
THYMUS
Compartiment myéloïde
B
8
Compatibilité donneur-receveur probabilité
cumulative de survie chez les patients atteints
de DICS après greffe de CSH
Apparenté, HLA partiellement incompatible n269

. Rejet (cellules NK de lhôte). Réaction du
greffon contre lhôte. Cellules T !
Registre Européen
9
Résultats à long terme

• Faible fonction des cellules T dans certains cas
• Déclin à long des terme des fonctions des
  cellules T
• Faible nombre de cellules NK
• Immunité des cellules B peu fréquente

10
Principe de la thérapie génique dans le DICS lié
à lX
Testé in vitro et in vivo(souris ?c KO)
11
DICS T- B
PATIENT
CONTROLE
CD3

CD19
RIL2 g /CD19
12
DICS-X1. un défaut du récepteur ?c
IL-15
NK
le défaut en gc
Absence de lymphocytes T et NK Léthal en
labsence de traitement La greffe de moelle
allogénique guérit mais
CLP
TCD4
IL-7
HSC
TCD8
B
13
Probability of survival of SCID patients
according to date of HSCT and to compatibility
Geno-id. 83
? 2000 73
URD 66

Pheno-id. 64
lt 2000 61
Survival
Haplo-id. 50
Survival
Haplo-id. 50
Months
Months
14
Thérapie Génique du DICS-XI Etudes précliniques
In vitro Lymphocytes B ?c(-) - faisabilité
- Etude de lexpression
et de la fonction Cellules CD34()
?c(-) - Etude de lexpression dans les
progéniteurs et à long
terme -
Différenciation cellulaire NK, T In vivo
Souris ?c(-) - Toxicité, faisabilité
- Avantage sélectif
15
Voie de signalisation ?c / JAK / STAT
IL-2
g
b
g
b
a
a
STAT5
STAT3
Dimérisation de STAT
Noyau
Fixation de STATs sur des sites spécifiques de
l ADN
15
16
Etudes pré-cliniques
Cellules EBV-B des patients DICS-X1
IL-2
?c 0
?
?
?
JAK1
Avant transduction
STAT5
J180
WBA
J30
?c 100
?c 50
0 IL2
0 IL2
0 IL2
Après transduction
?c-
?c
Contrôle
17
Transduction de cellules Sca1 Rag ou
Artemis-/- (Rétrovirus dérivé de MFG)
Surnageant rétroviral MFG- gc ou RAG ou Artémis
RAG2-/- C57BL/6
Sélection positive de Sca1
Moelle Osseuse
Transplantation (106 cellules)
SCF, Flt-3 L, Tpo, Il-6, Il-11, Il-7 (3 Cycles,
5j)
RAG2-/- C57Bl/6
3 Gy Irradiation
18
Pourcentage de Survie
Semaines
19
Recherche Translationnelle

• Secteur spécifique de la thérapie cellulaire,
  chargé de traduire une expérience réalisée à
  léchelle de laboratoire dans une expérience à
  large échelle utilisable pour lhomme

20
Calendrier de la phase translationnelle
21
Manipulation cellulaire de grade
cliniqueDescription du processus depuis le
concept jusquà la transplantation
22
Sécurité et Réglementation (1)

• Laboratoire accrédité pour la production du
  vecteur
• Absence de micro-organismes dans les cellules de
  production du vector et dans le surnageant
• Absence de virus compétent pour la réplication
  dans les lots cliniques ainsi que dans les
  échantillons des patients
• Le laboratoire doit être accrédité par les
  autorités compétentes et doit recevoir
  lautorisation du Ministère

23
Sécurité et Réglementation (2)

• Autorisation obtenue pour le protocole par
• 1) Administration de lAP-HP
• 2) Agence française du médicament

AFSSAPS
3) CCPAP
24
Enfant
Injection I.V.
Moelle osseuse
Lavage des cellules
Purification decellules précurseurs(CD34)
J4
J1  Activation 
J3
J2
Infection par le rétrovirus contenant le gène gc
25
Essai Clinique de TG pour le DICS-XI (1er
Janvier, 2012)
Patient Suivi(années) Expression de ?c T B Etat clinique
Patient Suivi(années) Expression de ?c Immunité Immunité Etat clinique
1 10.6 Vivant, va bien
2 10.4 Vivant, va bien
3 .7 - - Vivant, va bien (greffe de MO)
4 (4.9) Décédé, "leucémie"
5 10.8 Vivant, va bien ,"leucémie",chimio
6 9.8 Vivant, va bien
7 9.6 Vivant, va bien "leucémie",chimio
8 9.0 Vivant, va bien
9 (3.1) - Décédé, infection (greffe de MO)
10 8.7 Vivant, va bien,"leucémie",chimio
Moyenne du suivi 11 ans, 8 patients vivants qui
vont bien
26
Restoration of immune parameters
Full correction of T-cell immunodeficiency
Phenotype, function, TCR repertoire diversity
P1
100
months after gene therapy
Correction of humoral function normal serum Ig
levels (except for 2 patients)
Differentiation of functional NK cells but
subsequent decrease HSCT (Limited expansion
capacity of NK cell precursors ?)
27
Outcome of gene therapy trials in 20 patients
with SCIDX1 (Paris-London data combined)
28
Transduction de progéniteurs multipotents (?)
T
NK
CLP
B
Sites dintégrationpartagés
Progeniteurrs multipotents
PMN
HSC
Monocyte
CMP

• Nbre de copies de vecteur dans les cellules B lt
  0.1 7 à 10 ans après TG
• CD15 négatives pour le transgène

29
Essai clinique TG SCID-X1 caractéristiques des
4 effets indésirables graves (EIG)
P4 P5 P7 P10
Age au traitement (mois) 1 3 8 8
Survenue de lEIG (mois) 30 34 68 33
Prolifération clonale T ?? T matures ?? T matures T Immatures Thymocyte cortical
Oncogène LMO2 LMO2 CCND2 LMO-2, BMI-1
2ème modifications génétiques t613 SIL-TALnotch mut, p16 del. p16 del. notch mut,p16 del.
Sensibilité au traitement -
30
Un effet indésirable sévère chez 4 patients à
Paris et chez 1 patient en Angleterre

• Prolifération monoclonale des lymphocytes
  T provoquée
• par l'insertion du rétrovirus dans un oncogène
• Facteurs associés infection virale, réponse
  immune,
• susceptibilité génétique
• Quelle attitude adopter ? suspension de
  l'essai, analyse du risque confrontée au
  bénéfice, changement du vecteur
• retour à la recherche fondamentale
• autour du virus et
• autour de la maladie

31
Structure du gène LMO-2 et intégration du provirus
32
Comment améliorer la Sécurité ?

• Sélection des patients ??
• Utilisation dun LTR self-inactivé (SIN)

Vecteur rétroviral LTR-dirigé MFG gc
Q
Y
U5
R

U5
R
IL2RG
MoLV
MoLV
SD
SA
Nouveaux vecteurs retroviraux SIN Sin11 / SRS11
Q
Y

U5
U5
R
R
IL2RG
MP
?
Prom.
PRE
SD
EF1?(S)
RSV
33
Le promoteur EF1? est moins mutagénique
Plt0.001
détection limite
SF
EFS
SF.HS4
Etude de clonogenicité in vitro (C. Baums lab.)
34
Comment améliorer lefficacité ?

• Pas indispensable pour le DICSIndispensable pour
  les maladies dans lesquelles le transgène ne
  fournit pas davantage sélectif

• Vecteurs lentiviraux ? du taux de transduction
  des cellules souches important pour les
  protocoles de TG pour ALD et ?-thalassémie

• ? Compétition avec les cellules non
  transduites cytoréduction (/- sélection)
  ? access to stem cell niches (anti c-kit ab)