Presentazione del corso

1
Presentazione del corso
CHIMICA DEGLI ALIMENTI Modulo B Chimica
analitica degli alimenti Corso di laurea in
Biologia Agroalimentare Dott. Maurizio
Aceto Tel. [phone] Email maurizio.aceto_at_unipmn
.it
2
Chimica analitica degli alimenti
Scopo dellanalisi sugli alimenti

• Aspetti legali
• Controllo dei limiti di legge
• Sostanze tossiche (es. aflatossine, mercurio)
• Pratiche illecite (zucchero nel vino)
• Aspetti nutrizionali
• Resveratrolo nel vino
• Vitamine, principi nutritivi
• Qualità degli alimenti

3
Importanza dellanalisi degli alimenti
Dal punto di vista sanitario, lanalisi degli
alimenti è lunica garanzia per la nostra salute
relativamente a ciò che mangiamo (a meno che ci
si possa fidare ciecamente del produttore). Le
frodi alimentari sono infatti alquanto diffuse e
non sempre è possibile portarle alla luce. La
frode può intervenire su vari livelli

• Un alimento è prodotto e commercializzato con
  materie prime di scarsa qualità
• Materie prime conservate non correttamente
• Materie prime contaminate (es. Hg in pesce, Mucca
  pazza)
• Trattamenti che causano contaminazioni
• Un alimento è commercializzato utilizzando un
  marchio o una denominazione non corrispondente
• Parmesan tedesco
• Vino non corrispondente alla denominazione
• Un alimento è commercializzato sostituendo
  completamente o parzialmente il prodotto
  autentico con unalternativa simile ma meno
  costosa
• succo darancio adulterato con succo di mela
• olio doliva miscelato con altri oli vegetali
• Un alimento è prodotto con procedimenti non
  conformi
• olio doliva extravergine prodotto per estrazione
  con solventi
• Un alimento è prodotto con pratiche non
  consentite
• zucchero nel vino o nei succhi di frutta

4
Frodi antiche e moderne
La falsificazione degli alimenti e delle bevande
non è un fenomeno nuovo ma piuttosto una pratica
molto antica della cui presenza nel passato
esistono importanti testimonianze. Nellantico
Egitto si impiegavano speciali attrezzi per
effettuare la bollatura delle carni macellate ed
impedire che con esse venissero vendute parti di
bestie morte per malattia. Un reperto di epoca
romana imperiale (I secolo d.C.) mostra unanfora
gallica recante un sigillo con una falsa
incisione del nome di un produttore campano (tale
M. C. Lassius) apposto da mercanti per far
credere che quella fosse la paternità del vino
posto nei contenitori, mentre si trattava di vino
proveniente dalla Narbona da cui essi lavevano
acquistato
5
Ancora nel primo secolo d.C. Plinio il Vecchio
descriveva la falsificazione di prodotti di largo
consumo, come il pepe e la farina che, quando
proveniva da cerali di scarso pregio, grazie ad
una serie di trattamenti, poteva essere
trasformata in un prodotto di prima qualità, per
la cui vendita si poteva esigere prezzi
superiori. Va detto che in tempi antichi le
adulterazioni erano grossolane (es. annacquamento
del latte) ma daltra parte non cera alcuna
nessuna protezione del consumatore
6
In Francia, tra il 1200 ed il 1400, si
moltiplicarono editti ed ordinanze contro i
malvagi frodatori che smerciavano carni alterate,
rovinate, gonfie, panetti di burro rancido tinti
con erbe e fiori gialli, birra ottenuta con
misture di bacche selvatiche, peperoncino, loglio
o pece resina In Germania, limperatore Federico
III emise duri provvedimenti per contrastare i
falsificatori di vino, a seguito di casi di
avvelenamento dovuti a certi mercanti di
Franconia, che avevano venduto come vino puro una
infusione in cui erano mescolate acqua di calce e
varie droghe nocive Anche Carlo V emanò rigide
disposizioni contro le frodi alimentari ma, pare,
senza ottenere grandi risultati
7
Cronistoria delle frodi

• Medio Evo primi esempi di adulterazione
  riportati
• Inizio del XVIII secolo controllo su certi
  alimenti (birra, vino, alcolici, tè) al solo
  scopo fiscale
• 1861 Uso del microscopio per certificare
  l'autenticità del caffè (a quel tempo
  estremamente costoso
• 1875 Sale of Food and Drug Act (UK). Un alimento
  viene considerato adulterato se
• Contiene ingredienti che lo rendono pericoloso
  per la salute del consumatore
• Contiene sostanze che ne aumentano il peso o il
  volume, a meno che queste non siano necessarie
  alla preparazione e vengano dichiarate al momento
  della vendita
• Un costituente importante è stato rimosso in
  tutto o in parte senza che questo venga
  dichiarato al momento della vendita
• È una imitazione, o viene venduto sotto il nome,
  di un altro alimento.
• 1931 Food and Drug Administration (FDA) (USA)
• 1962 Codex Alimentarius Commission (FAO)
  Unione Europea

8
Aspetti positivi
Attualmente le condizioni sono diverse, non
necessariamente migliori. Gli aspetti positivi
sono i seguenti

• l'industria produce alimenti confezionati secondo
  standard definiti
• i metodi di analisi sono sofisticati, quindi le
  frodi più grossolane vengono facilmente
  smascherate. Frodi recenti come il vino al
  metanolo non sono più possibili
• i metodi vengono usati dalle industrie stesse per
  far fronte al crescente grado di consapevolezza
  dei consumatori
• il valore nutrizionale degli alimenti è
  generalmente garantito
• cè particolare attenzione alle qualità
  edonistiche in senso lato (origine geografica,
  genuinità, assenza di contaminazioni)
• generalmente le frodi non comportano più
  l'aggiunta di sostanze nocive (con notevoli
  eccezioni...)

9
Aspetti negativi

• ladulterazione è rivolta ad alimenti di alto
  valore commerciale (olio d'oliva, vini, tartufi,
  ecc.) sui quali il giro di affari è
  incredibilmente aumentato
• la frode è molto più sofisticata pensata per
  frodare criteri quali l'origine controllata, la
  presenza di additivi naturali o artificiali, fino
  alla presenza di organismi geneticamente
  modificati

10
Legislazione vigente
La legislazione vigente differisce a paese a
paese. Si considerino le differenze relative ai
limiti di metalli tossici nel vino
11
Parametri comuni
Tuttavia, in molti Paesi un alimento viene
considerato adulterato se

• contiene materiale vegetale o animale sporco,
  putrefatto, decomposto o malato
• è infestato da insetti o inadatto al consumo
  umano
• è confezionato o conservato in condizioni non
  igieniche
• contiene ingredienti tossici
• è stato sostituito con sostanze inferiori o meno
  costose
• sono stati rimossi alcuni dei suoi costituenti
• è imballato con materiali tossici o nocivi
• contiene additivi proibiti, o additivi consentiti
  in quantità superiori ai limiti prescritti
• la sua qualità è inferiore allo standard
  prestabilito
• è di natura o qualità diversi dal dichiarato, o
  utilizza descrizioni false o fuorvianti

12
Aspetti nutrizionali
Dal punto di vista nutrizionale, lanalisi degli
alimenti ci dà unidea (evidentemente non
esaustiva) dei potenziali benefici apportati
dallassunzione degli alimenti. Per questo motivo
sulletichetta di molti prodotti sono riportate
le determinazioni di parametri quali

• vitamine
• sali minerali (sottolineando a volte la carenza,
  a volte labbondanza)
• macromolecole (proteine, grassi, carboidrati,
  ecc.)
• principi nutritivi non meglio identificati (Omega
  3, triplo acido di frutti...)

13
Aspetti commerciali
Va considerato che, spesso, laspetto
nutrizionale è sfruttato ad arte a scopi
commerciali, per evidenziare le caratteristiche
di un prodotto in maniera non
troppo realistica. Questo perchè lanalisi degli
alimenti ha ormai assunto unimportanza notevole,
vista lespansione del mercato alimentare,
soprattutto per quei settori dove la ricerca di
valore aggiunto a tutti i costi fa leva su
informazioni scientifiche o pseudo-scientifiche
14
Parametri analitici studiati
Il numero di sostanze di interesse nel campo
agroalimentare è ovviamente elevatissimo.
Soltanto in relazione agli aspetti sanitari,
possiamo stimare in diverse decine di migliaia le
specie chimiche classificate come indesiderate,
comprendenti le seguenti classi

• Metalli pesanti (As, Cd, Hg, Pb) e transizione
  (Cr, Co, Ni, Cu, Zn)
• Specie metalliche
• composti organometallici (metilmercurio,
  tetraetilpiombo, ecc.)
• ioni metallici a diverso stato di ossidazione,
  es. Cr(III) e Cr(VI)
• Composti inorganici
• sali minerali (nitriti, nitrati, fosfati, ecc.)
• Composti organici
• derivanti da reazioni chimiche (PAH, PCB, BTEX,
  diossine)
• derivanti da attività biologica (aflatossine)
• residui di composti impiegati nella produzione
  (pesticidi, fungicidi)

15
Quali parametri analitici?
Proprio per lelevata quantità di sostanze
potenzialmente indesiderate, risulta impossibile
poter avere un quadro tossicologico completo di
un alimento. A seguito di ricerche mirate, nel
corso degli anni sono stati sviluppati test
analitici che hanno come target un numero
ristretto di composti o elementi tossici, in
stretta relazione ai processi produttivi
coinvolti nelle filiere alimentari o ai metodi di
stoccaggio e conservazione delle derrate. I punti
critici da tenere sotto controllo possono essere

• La qualità delle materie prime (assenza di
  composti indesiderati)
• I processi di trasformazione delle materie prime
  (conversione di sostanze presenti nelle materie
  prime in composti indesiderati)
• Laddizione al prodotto di sostanze aventi
  funzioni varie (apporto di composti indesiderati)
• I materiali di contenimento (cessione dalla
  superficie)
• Le condizioni di conservazione (effetto di
  temperatura, umidità, esposizione alla luce)

16
Evoluzione delle conoscenze
Il quadro dei parametri analitici sugli alimenti
è necessariamente in evoluzione, sullonda
emotiva degli eventi (vedi caso Mucca pazza...) o
in risposta a studi tossicologici aggiornati Se
consideriamo i secoli passati, è evidente che la
mancanza di nozioni sufficienti rendevano
desiderabile in campo agroalimentare limpiego di
sostanze che al giorno doggi non ci sogneremo di
utilizzare Durante l'ultima metà del XIX secolo,
i progressi in chimica organica resero
disponibili una quantità di sostanze sintetiche,
la cui utilità venne provata in vari campi, ad
esempio la saccarina ed i coloranti azoici. Allo
stesso tempo, essendo stata accertata lorigine
batterica di certe malattie, furono introdotti
vari agenti antimicrobici per la conservazione
delle derrate (ad es. il creosoto, l'acido
borico, l'acido salicilico). Tuttavia, le
implicazioni tossicologiche collegate al loro uso
emersero solo gradualmente e con ritardo. Da
questo riconoscimento sorsero le prime
regolamentazioni sull'uso degli tali additivi
17
Progressi delle scienze mediche
I progressi in microbiologia hanno reso possibile
la connessione tra agenti patogeni e malattie,
così da evidenziare il rapporto causale tra certe
intossicazioni o malattie vere e proprie e agenti
patogeni contenuti nei generi alimentari (ad es.
Salmonella, botulismo, micotossine) Tuttavia le
intossicazioni alimentari sono ancora possibile a
causa di pratiche fraudolente
18
Gli scherzi della Natura
Spesso è accaduto che la Natura abbia fatto
brutti scherzi, con conseguenze sanitarie
drammatiche. Il caso di Minamata è sintomatico,
dal punto di vista sia del rispetto ambientale,
sia del progresso della conoscenza scientifica
Negli anni 50, scarichi industriali nella baia
di Minamata (Giappone) provocarono un grave
inquinamento da mercurio, con circa 10.000
avvelenati per danni al sistema nervoso centrale.
Lavvelenamento fu causato da composti di Hg
presenti nei pesci e nei molluschi che
costituivano la principale fonte di proteine per
la popolazione della baia
19
Minamata
Prima di questo incidente era noto soltanto il
rischio occupazionale da esposizione, ma in
seguito a Minamata furono focalizzati due
aspetti Prima di Minamata nessuno si
sarebbe sognato di cercare composti
organomercurici negli alimenti

• Alcuni organismi (tra cui pesci e molluschi) sono
  in grado di concentrare specie metalliche nei
  loro organi, in particolare nei tessuti lipidici
• Questi organismi sono in grado di attivare
  processi biochimici per limitare la tossicità
  delle specie assorbite uno dei meccanismi è la
  biometilazione
• Hg2 CH3 ? CH3Hg

20
Parametri qualitativi
Oltre ai parametri determinati di routine per
motivi sanitari, sono poi in aumento i test che
rispondono alla necessità di autenticare gli
alimenti o di qualificarli dal punto di vista
della qualità, soprattutto per i prodotti di
maggior pregio. Sempre più spesso i disciplinari
di produzione o le normative prevedono limpiego
di questi test per permettere lo sfruttamento
commerciale di determinate etichette (es. olio
extravergine) Alcuni tra i parametri analitici
determinati a scopo qualitativo sono

• Alcuni elementi (selenio, calcio, ferro, in dosi
  opportune)
• Composti antiossidanti come i polifenoli o i
  tocoferoli
• Vitamine
• Molecole con funzionalità particolari (es.
  resveratrolo nel vino rosso)

21
Concentrazione ottimale
La semplice indicazione della presenza o assenza
delle sostanze non è di per sè informazioni
sufficiente a valutare un alimento dal punto di
vista sanitario. Ad esempio, il comportamento
fisiologico dei metalli si può rappresentare con
una curva gaussiana A concentrazioni
basse si ha carenza dellelemento, a
concentrazioni troppo alte si ha eccesso. La
concentrazione ottimale corrisponde al massimo
della curva
22
Concentrazione o speciazione?

• Oltre al semplice dato di concentrazione, in
  certi casi sarebbe più utile indicare la specie
  in cui un certo analita si trova, ovvero
  effettuare la speciazione dellanalita. Come il
  citato caso di Minamata dimostra, la tossicità di
  un analita, o comunque le sue potenzialità di
  interazione con lorganismo, dipendono non solo
  dalla sua concentrazione ma anche dalla forma
  chimica in cui esso si trova. Nel caso del
  mercurio si ha una tossicità crescente nella
  serie
• sali inorganici, es. HgCl2, Hg(NO3)2
• composti di organomercurio, es. metilmercurio,
  dimetilmercurio
• vapori di mercurio elementare

23
Questa esigenza è a volte soddisfatta nei casi
semplici, come nella coppia Cr(III)/Cr(VI) in cui
i due stati di ossidazione del cromo hanno
tossicità notevolmente diversa. Raramente, però,
si va oltre. Ad esempio quasi mai si prende in
considerazione la cosiddetta frazione disponibile
di un analita, cioè quella più attiva dal punto
di vista fisiologico in quanto può essere
liberata facilmente da un campione solido ed
entrare in contatto con lorganismo Ciò è dovuto
principalmente al fatto che le analisi di
speciazione sono più complesse e quindi costose
24
Considerazioni sulle tecniche
La chimica analitica degli alimenti è una
disciplina piuttosto complessa, in quanto il
numero di sostanze dinteresse (o analiti) è
ovviamente elevato, comprendendo sia le specie di
interesse nutrizionale (vitamine, principi
attivi, carboidrati, micrelementi, ecc.) sia le
sostanze indesiderate o contaminanti (metalli
pesanti, pesticidi, fitofarmaci, ammine biogene,
ecc.). Inoltre, le matrici considerate vanno
dallacqua potabile alle carni al miele,
imponendo metodi di trattamento molto diversi da
una matrice allaltra Per questi motivi, è
praticamente impossibile adottare procedure
analitiche comuni per la caratterizzazione di
tutti i tipi di alimenti. Ogni alimento e ogni
classe di analiti richiedono una procedura
specifica. Esistono al proposito metodi
standardizzati, frutto di anni di ricerche
25
Tecniche analitiche utilizzate
Le tecniche che si usano correntemente per
determinare gli analiti si possono riassumere
nellelenco seguente Sono saltuariamente
utilizzate anche tecniche elettrochimiche
(polarografia, potenziometria) e alcune tecniche
di analisi su solido (Raman, NIR) Tecniche più
sofisticate con la spettroscopia NMR o lanalisi
degli isotopi stabili con spettrometria di massa
sono utilizzate per determinazioni di
autenticità Le tecniche utilizzate saranno
richiamate o introdotte volta per volta

• Tecniche di spettroscopia atomica (GF-AAS, FAAS,
  ICP-AES, ICP-MS) per la determinazione elementare
• Tecniche cromatografiche (HPLC, IC, GC) per la
  separazione e determinazione di miscele di
  composti organici ed inorganici
• Tecniche spettrofotometriche (UV-visibile, IR)
  per la determinazione di parametri analitici o di
  specie che assorbono nellintervallo UV-IR
• Tecniche volumetriche (titolazione acido-base,
  redox) per la determinazione di parametri vari

26
Il pretrattamento
Lanalisi degli alimenti richiede generalmente
uno stadio preliminare che consiste nel portare
il campione (tecnicamente la matrice) nella forma
più opportuna ai fini della determinazione
analitica. Linsieme delle procedure richieste
per avere lanalita o gli analiti di interesse in
forma determinabile è definito pretrattamento.
Esso è un punto essenziale del metodo analitico,
importante quanto la determinazione
quali-quantitativa La stragrande maggioranza
delle analisi in chimica agroalimentare si
effettuano per via umida. Ciò significa che il
campione, se non è già liquido, va portato in
soluzione o quantomeno va solubilizzata la parte
che contiene lanalita o gli analiti di
interesse. Generalmente, quindi, il
pretrattamento coincide o termina con uno stadio
di solubilizzazione. In rari casi è possibile
effettuare lanalisi sul campione tal quale,
utilizzando tecniche non distruttive come la
spettrometria Raman o la spettrometria NIR La
varietà delle matrici considerate in chimica
agroalimentare fa sì che sia difficile enunciare
regole valide per ogni tipo di alimento. A
seconda della natura chimica dellalimento
(organica o inorganica acida, basica o neutra
solubile in solvente acquoso o in solventi
organici) e della tecnica analitica utilizzata,
sarà selezionato il metodo di pretrattamento più
opportuno
27
Tipi di pretrattamento
I metodi di pretrattamento più frequentemente
utilizzati nellanalisi agroalimentare sono i
seguenti

• Incenerimento
• Digestione umida con reattivi di solubilizzazione
  e/o ossidazione
• In sistemi chiusi
• Con microonde
• Separazione con membrane
• Filtri
• Ultrafiltrazione
• Dialisi

• Estrazione
• Con solvente
• Con solvente accelerata (ASE)
• Con un fluido supercritico (SFE)
• Con fase solida (SPE)

28
Incenerimento
Lincenerimento (ashing in inglese) consiste nel
trattare un campione solido sottoponendolo a
temperature elevate senza fiamma, in modo da
causare la parziale o totale decomposizione delle
sostanze organiche presenti e di parte di quelle
inorganiche Normalmente una temperatura compresa
tra 450 e 600C è sufficiente per degradare la
maggior parte delle molecole organiche a molecole
più semplici o semplicemente a vapore acqueo ed
anidride carbonica Naturalmente nella
scelta della temperatura va tenuto conto della
possibile perdita di analiti, soprattutto per
quanto riguarda elementi volatili come As, Cd,
Hg, Pb, Sb, Sn e Zn, sia presenti come elementi
puri, sia come composti. Lapplicabilità va
quindi verificata analizzando materiali
certificati
29
(No Transcript)
30
Residuo dellincenerimento
Il residuo di questo trattamento termico può
essere composto da ossidi e da sali poco volatili
(fosfati, cloruri, solfati, silicati di metalli
alcalini e alcalino-terrosi), di colore
biancastro. Una colorazione nera o bruna è indice
di un incenerimento parziale, in cui parte delle
sostanze organiche sono rimaste
incombuste Da quanto detto si deduce che
questo pretrattamento è adatto principalmente
alla determinazione di parametri inorganici, come
il contenuto di metalli, anioni o il residuo secco
31
Principio del metodo
Il procedimento consiste nel pesare una quantità
nota di campione e porla in un crogiolo o in un
contenitore apposito (ovviamente termoresistente,
es. vetro Pyrex). Il contenitore è poi inserito
allinterno di un forno o muffola che viene
sottoposto ad un ciclo di temperatura crescente,
in cui la temperatura finale dipende dagli
analiti e deve quindi essere inferiore al punto
di ebollizione degli

• analiti stessi. Il trattamento in muffola può
  essere preceduto da un breve trattamento di
  essiccamento a 120-180C per eliminare lacqua ed
  evitare così reazioni violente di ebollizione a
  temperature più alte
• Al termine dellincenerimento si attende il tempo
  necessario al raffreddamento e poi si preleva il
  contenitore. Se si è interessati soltanto al
  residuo secco è sufficiente pesare il crogiolo
  prima e dopo lincenerimento, mentre se si è
  interessati a determinare alcuni analiti è
  necessario portare in soluzione il residuo che
  però solitamente è costituito da sostanze
  facilmente solubilizzabili in acqua o in acidi
  (nitrico, cloridrico)

32
Vantaggi e svantaggi

• VANTAGGI
• non richiede luso di reagenti
• molto economico
• scarso pericolo di contaminazione
• molto semplice da eseguire
• elevato numero di campioni trattabili
  simultaneamente (dipende dalle dimensioni del
  forno)
• SVANTAGGI
• richiede muffola a temperatura controllata (costo
  iniziale)
• processo lungo (12-18 ore)
• richiede una certa attenzione per le reazioni che
  può provocare
• perdite di campione ? perdita di analita
• combustione ? danno al forno
• emissione di vapori
• non adatto per determinazione di composti
  volatili (es. Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, P)
• non adatto per la maggior parte dei composti
  organici
• rischio potenziale di interazione tra i sali e il
  crogiolo

33
Digestione umida
Si tratta di una tecnica di pretrattamento molto
utilizzata per la determinazione di specie
inorganiche (metalli, anioni), mentre non è
adatta per la determinazione di specie organiche
che subiscono degradazione termica. Il processo
di digestione avviene allinterno di un
contenitore nel quale sono introdotti il campione
finemente suddiviso e i reattivi di
solubilizzazione, eventualmente coadiuvati da
reattivi di ossidazione. Generalmente sono
utilizzati acidi puri o in miscela

• Acido nitrico, esercita azione ossidante a caldo
  ed è in grado di rompere i legami glicosidici
• Acido solforico, esercita azione ossidante e
  disidratante
• Acido perclorico, esercita azione ossidante
• Acqua regia (acido nitrico cloridrico 13),
  esercita azione ossidante molto forte
• Acqua ossigenata, esercita azione ossidante

34
Precauzioni nella digestione
Le quantità di reagenti e di campione introdotte
devono essere compatibili con il volume del
sistema. Considerando che la maggior parte delle
matrici alimentari contiene sostanze organiche,
va considerata la liberazione di composti gassosi
conseguenti alla digestione, che può provocare
sovrapressioni (C, H, O) O2 (acido ossidante)
? H2O CO2 Il volume dei gas liberati è
ovviamente molto maggiore rispetto alla miscela
campione-reagenti di partenza Il contenuto di
carbonio nei cibi è quindi un valore da tener
presente nel progettare un pretrattamento per
digestione umida
35
Applicazioni della digestione
La reazione di digestione può avvenire a
temperatura controllata. Lavorando in sistema
chiuso, è possibile raggiungere temperature
superiori a quelle di ebollizione degli acidi a
temperatura ambiente, con aumento delle proprietà
solubilizzanti e ossidanti dei reagenti
impiegati inoltre il sistema chiuso limita le
perdite di campione per volatilizzazione Nel
dettaglio delle varie matrici, la digestione
umida è particolarmente efficace per il
pretrattamento di alimenti a base di carboidrati
(zuccheri, amidi, cellulosa, ecc.) che sono
facilmente mineralizzati con acido nitrico a
180C più complessa è la solubilizzazione di
matrici contenenti grassi e proteine, che può
richiedere laddizione di acido perclorico per
avere una dissoluzione completa. In questo caso
il trattamento va effettuato con cautela
36
Digestione umida con microonde
Una variante più efficace della semplice
digestione umida prevede lutilizzo di microonde
per il riscaldamento del sistema. Lenergia
associata alle microonde (600-1500 W nelle
apparecchiature da laboratorio) non è in grado di
rompere direttamente i legami molecolari, ma può
essere assorbita da sostanze come lacqua e gli
acidi minerali, che in questo modo si scaldano
rapidamente e, in un sistema chiuso, sono in
grado di solubilizzare il campione in maniera più
efficiente e in tempi minori La digestione
avviene generalmente in contenitori di materiale
inerte e trasparente alle microonde come il
Teflon o Politetrafluoroetilene (PTFE) e il
Perfluoroalcossifluorocarbonio (PFA). Il
trattamento delle matrici organiche va effettuato
con grande attenzione, visto linnalzamento
rapido di temperatura e pressione che si ha
allinterno dei contenitori. Per evitare che si
inneschino reazioni incontrollabili se non
esplosive, generalmente è possibile controllare
con dei sensori temperatura e pressione dei
contenitori
37
Esempi di trattamento con microonde
La maggior parte delle matrici organiche può
essere solubilizzata con acido nitrico
concentrato 2 ml sono sufficienti per la
digestione di 100-200 mg di campione di tessuti
animali come carne e pesce, frutta e verdura,
bevande con alto contenuto di sostanze organiche
(the, vino, birra), latte e derivati. Nei casi
più difficoltosi è possibile addizionare acqua
ossigenata, acido perclorico o solforico, ma sono
necessarie particolari precauzioni per evitare
reazioni esplosive
Ciò è necessario, ad esempio, per la
solubilizzazione di farine e prodotti da forno e
in generale per alimenti con alto contenuto di
grassi e proteine Spesso i sistemi di digestione
con microonde esistenti in commercio prevedono la
possibilità di trattare contemporaneamente più
campioni, ciascuno nel proprio contenitore, e ciò
abbrevia notevolmente i tempi di analisi
38
Estrazione con solvente
Si tratta di una tecnica di pretrattamento molto
comune, utilizzata in tutti i casi in cui non è
necessaria o è anzi controindicata la
solubilizzazione totale del campione. Permette di
portare in soluzione selettivamente gli analiti
di interesse, lasciando la matrice quasi intatta.
Si effettua in contenitore chiuso ponendo il
campione a contatto con un solvente con esso
immiscibile, nel quale siano però solubili gli
analiti. Si può avere

• Estrazione liquido/liquido se sono liquidi sia il
  campione sia il solvente estraente
• Estrazione liquido/solido se si effettua con un
  solvente liquida su un campione solido

39
Esecuzione dellestrazione
Lestrazione si effettua ponendo in agitazione il
campione e il solvente in un imbuto separatore
per un tempo determinato (A), attendendo la
separazione di fase (B) e recuperando la fase
solvente che contiene gli analiti estratti di
interesse (C) secondo una modalità che dipende
dalla sua densità prelevandola dal basso se è la
fase più densa, scartando la fase inferiore e
prelevando il residuo se è invece la fase meno
densa Lampia gamma di solventi disponibili
permette di effettuare estrazioni molto
selettive. Nellesecuzione, va considerato il
fatto che si utilizzano quasi sempre solventi
organici e quindi tossici
40
Estrazione con Soxhlet
Un strumento molto utilizzato nel pretrattamento
di campioni agroalimentari è lestrattore
Soxhlet, che consente di effettuare lunghi cicli
di estrazione in modalità semiautomatica con buon
recuperi. Il campione è posto allinterno di un
ditale poroso permeabile al solvente estraente.
Attraverso un sistema ciclico di ebollizione,
condensazione e ricaduta, il solvente è
in grado di agire sul campione più volte,
estraendo gli analiti con maggiore efficienze
rispetto allestrazione classica in imbuto
separatore La procedura è automatizzabile in
batteria per poter agire su più campioni
contemporaneamente
41
Modalità di estrazione

• Imbuto separatore
• pochi campioni
• piccole quantità di campione
• oppure
• elevate quantità di solvente
• Estrattore di Soxhlet
• numerosi campioni
• grosse quantità
• batteria di estrattori (Soxhtec)

42
Estrazione accelerata (ASE)
Lestrazione con solvente tradizionale, pur
garantendo ottime prestazioni, presenta alcuni
inconvenienti tra cui i tempi lunghi di
trattamento, le elevate quantità di solvente
utilizzato e la scarsa adattabilità
allautomazione. Per questo motivo, sono state
sviluppate alcune varianti. Nellestrazione
pressurizzata o accelerata con solvente (PSE o
ASE) si utilizza un solvente in condizioni
sub-critiche, nelle quali lefficienza di
estrazione è molto maggiore. Si lavora in
recipiente chiuso, pressurizzato e termostatato.
Ciò consente di ridurre i tempi di estrazione e
la
quantità di solvente necessaria inoltre è
possibile automatizzare il processo La tecnica
ASE è ormai duso corrente per il trattamento di
campioni agroalimentari. Esempi di applicazioni
in cui la tecnica è preliminare allanalisi
cromatografica sono

• Estrazione di pesticidi fosforici da frutta e
  verdura con acetato di etile
• Estrazione di idrocarburi policiclici aromatici
  (PAH) da cibi affumicati con miscela
  diclorometano/acetonitrile
• Estrazione di composti organico-arsenici da pesce
  con miscela acqua/metanolo

43
Estrazione con fluidi supercritici
In questa variante dellestrazione liquido/solido
si utilizza, al posto del solvente, un fluido
supercritico, cioè una sostanza portata al di
sopra della pressione e della temperatura
critiche, quindi con un comportamento intermedio
tra gas e liquidi la diffusione nei solidi è
paragonabile a quella dei gas, mentre la capacità
di solubilizzazione è quella dei liquidi inoltre
i fluidi supercritici possono solvatare a
groalimentare per lestrazione della caffeina dai
chicchi di caffè e degli olii essenziali dai
prodotti vegetali. Attualmente le applicazioni
sono numerose la tecnica (preliminare
allanalisi con cromatografia fluida
supercritica, SFC) risulta particolarmente
efficiente nellestrazione di grassi dagli
alimenti, ma è impiegata anche per pesticidi,
glucosidi, vitamine, ecc.
molecole grandi non volatili. Queste
caratteristiche rendono i fluidi supercritici
estremamente efficienti nel processo di
estrazione, senza presentare gli inconvenienti
dei solventi liquidi dal punto di vista di prezzo
e pericolosità Il fluido più utilizzato per
lestrazione è la CO2 che ha caratteristiche di
prezzo e inerzia chimica ottime e valori critici
molto bassi a 40C e 378 Atm il suo potere
solvatante è paragonabile a quello del benzene La
tecnica SFE è utilizzata già da tempo in campo
44
Estrazione con fasi solide (SPE)
Lestrazione con fasi solide prevede lutilizzo
di una fase estraente, appunto, solida,
normalmente costituita da una colonnina impaccata
con materiale avente proprietà sorbenti. Si
tratta di una tecnica molto diffusa e utilizzata
in tutti campi della chimica analitica, sia per
estrarre selettivamente gli analiti di interesse,
sia per purificare i campioni che si vogliono
analizzare (es. precolonne per cromatografia) La
tecnica sfrutta quindi laffinità di una fase
sorbente per alcune sostanze presenti nel
campione, che possono essere sia gli analiti di
interesse sia sostanze interferenti che si
desidera eliminare dal campione. La scelta del
materiale sorbente più opportuno rende possibile
modulare la procedura a seconda delle necessità
45
Passaggi nella SPE
Il procedimento consta delle seguenti
fasi Se si desidera eliminare
gli interferenti anzichè trattenere gli analiti,
è sufficiente usare una fase solida con affinità
per i composti che si vuole eliminare dal campione
46
Fasi sorbenti

• I meccanismi su cui si basa il trattenimento
  delle sostanze su fase solida sono tre
• Adsorbimento, dovuto a forze di Van der Waals,
  legami idrogeno, interazioni dipolo-dipolo
• Ripartizione di un soluto tra due fasi
  immiscibili
• Interazione coulombiana tra cariche di segno
  opposto

Su questi principi funziona la maggior parte
delle fasi solide utilizzate per la SPE, che sono
molto simili a quelle impiegate in cromatografia
liquida. A seconda del tipo di composto che si
vuole trattenere (non polare, polare o ionico) si
possono scegliere le seguenti fasi La fase
non polare Si-C18 è una delle più utilizzate per
lanalisi alimentare come filtro per la rimozione
di interferenti idrofobici, es. composti organici
nel vino e nel mosto Le fasi a scambio ionico
sono utilizzate per il trattenimento di analiti
ionici o ionizzabili come pesticidi, erbicidi,
tossine, ecc.
47
Fasi eluenti
Il desorbimento degli analiti o eluizione è
effettuato facendo passare sulla colonnina un
piccolo volume di solvente che recupera le
sostanze trattenute. Il volume delleluente può
essere ridotto per incrementare la sensibilità
del metodo analitico Per la scelta delleluente è
necessario tenere conto del tipo di interazione
stabilito tra la fase solida sorbente e
lanalita leluente deve avere uninterazione
con lanalita maggiore di quella che questultimo
ha con la fase sorbente Eluenti tipici possono
essere

• una soluzione acida (HNO3, HCl) per eluire ioni
  metallici da una fase a scambio ionico
• un solvente organico a polarità varia (metanolo,
  diclorometano, acetonitrile) per eluire composti
  organici da una fase Si-C18

48
Compatibilità con la tecnica analitica

• Un parametro importante per scegliere il sistema
  SPE e in particolare la fase eluente consiste
  nella compatibilità con la tecnica analitica. In
  particolare, se successivamente al pretrattamento
  si impiega una tecnica cromatografica possono
  esserci dei vincoli
• tolleranza del sistema cromatografico a solventi
  organici
• tolleranza a valori di pH estremi (eluente molto
  acido o molto basico)
• tolleranza a contenuto salino elevato
• Ad esempio, se dopo il trattamento SPE è prevista
  la separazione su una colonna Si-C18, stabile
  fino a pH 7, non si potrà evidentemente
  utilizzare un sistema SPE che preveda luso di un
  eluente basico

49
Applicazioni della SPE
Le applicazioni della tecnica SPE in campo
agroalimentare sono numerosissime. Naturalmente i
campioni liquidi sono quelli più idonei al
trattamento con SPE preliminare allanalisi vera
e propria nellanalisi di campioni solidi è
necessario uno stadio di solubilizzazione o di
estrazione con solvente. Alcuni esempi di
applicazioni sono i seguenti

• Estrazione di composti volatili, acidi grassi ed
  esteri dal vino si ottiene con una fase
  estraente a fase inversa del tipo Si-C18 o Si-C8
• Estrazione di antocianine e polifenoli dal vino
  si ottiene con una fase estraente polimerica a
  base di polivinilpirrolidone (PVP)
• Purificazione di un campione liquido da cloruri
  si ottiene con una fase estraente contenente ioni
  Ag, con i quali lo ione Cl- forma AgCl insolubile

50
Verifica delle condizioni
Per ottenere un trattenimento efficiente, è
sempre opportuno verificare il campo di
applicazione della fase estraente. In particolare
il pH del campione può essere decisivo nel
successo di una procedura SPE, in quanto a
seconda del pH molte sostanze possono avere un
comportamento ionico o non ionico, acido o
basico, ecc. Nel caso, ad esempio del
trattenimento di acidi carbossilici su fase
inversa Si-C18, esso si può realizzare già a pH
debolmente acido, al quale gli acidi carbossilici
sono protonati e quindi hanno un comportamento
non ionico per valori di pH elevati nel
campione, invece, gli acidi potrebbero essere
parzialmente deprotonati e quindi non essere
trattenuti su una fase estraente apolare
51
Preconcentrazione con SPE
Un impiego importante della SPE consiste nel
preconcentrare gli analiti di interesse
preliminarmente allanalisi, cioè
nellincrementare la concentrazione degli analiti
nel campione se questa è troppo bassa per poter
essere misurata con gli strumenti a
disposizione La preconcentrazione si ottiene
facendo fluire volumi elevati di campione sulle
colonnine se lanalita o gli analiti sono
completamente trattenuti dalla fase estraente, è
possibile ottenerne il rilascio utilizzando un
piccolo volume di eluente. Se il volume di
eluente è inferiore al volume di campione
caricato e se il trattenimento e il rilascio
degli analiti sono quantitativi, si avrà un
incremento della concentrazione degli analiti che
può essere quantificato in ragione del
rapporto Vc/Ve Naturalmente leluente dovrà
essere scelto in modo che sia sufficientemente
forte da desorbire tutto lanalita trattenuto in
un piccolo volume Il sistema fase solida
estraente/eluente può essere scelto in modo da
ottenere contemporaneamente la preconcentrazione
degli analiti e la rimozione delle sostanze
interferenti
con Vc volume di campione caricato sulla fase
estraente Ve volume di eluente
52
Microestrazione in fase solida
Nella microestrazione in fase solida (SPME) una
fibra ricoperta di materiale sorbente è immersa
in un campione liquido, oppure in recipiente
chiuso nello spazio di testa di un campione
liquido o solido (1) le sostanze che hanno
affinità per la fase sorbente vengono estratte
(2) e possono essere rilasciate per riscaldamento
della fibra (3), cosa che può avvenire
nelliniettore di un gascromatografo (4). Il
carico di sostanze che entrano in colonna è
alquanto limitato, in particolare nella versione
che agisce sullo spazio di testa
53
In questa figura si vede meglio lassemblaggio
della sonda SPME. Il materiale attivo dal punto
di vista della sorzione è limitato alla fibra
interna, che viene esposta soltanto al momento
opportuno, cioè a contatto con il campione o con
il suo spazio di testa, per evitare assorbimento
di sostanze volatili dallaria Le fasi sorbenti
disponibili sono analoghe a quelle impiegate in
SPE ma principalmente utili per la determinazione
di sostanze volatili o semivolatili a vario grado
di polarità
54
Esempio di analisi SPME/GC-MS
Lapplicazione tipica del metodo SPME si ha nella
caratterizzazione di composti volatili in
accoppiamento alla tecnica GC-MS. Ad esempio
nellanalisi del vino esso permette di
determinare un numero elevato di sostanze
volatili, importanti per definirne il quadro
aromatico. In un vino sono determinabili 50-100
sostanze aventi caratteristiche di volatilità, in
prevalenza alcoli, terpeni ed esteri (nella
figura estratto SPME da un Nebbiolo)
55
Separazione con membrane

• Nelle determinazione di parametri inorganici nel
  latte (anioni, cationi) mediante cromatografia,
  il campione non può essere iniettato direttamente
  in colonna sia a causa del suo elevato contenuto
  salino, sia soprattutto a causa dei colloidi
  dispersi presenti in grande quantità, che
  intaserebbero la fase stazionaria. In casi come
  questo, in cui cioè il campione non sia omogeneo,
  è spesso consigliabile o necessario procedere
  alla separazione delle fasi che compongono il
  campione, in particolare quelle non in soluzione
  che potrebbero creare problemi al sistema di
  misura
• La separazione può essere effettuata in diversi
  modi
• precipitando le fasi interferenti e poi
  filtrando la soluzione restante
• utilizzando filtri in base al peso molecolare
  (ultrafiltrazione)
• sfruttando la dialisi

56
La dialisi
Il pretrattamento con dialisi sfrutta la
migrazione di sostanze a basso peso molecolare
attraverso una membrana di materiale polimerico
(es. acetato di cellulosa), impermeabile al
passaggio di particelle grandi (gt 0.2 µm), fino a
raggiungere lequilibrio tra il campione e una
soluzione accettore I pazienti che soffrono di
insufficienza renale cronica utilizzano questo
metodo. A causa di questa disfunzione, nel loro
sangue i composti ionici a basso peso molecolare
si accumulano a concentrazioni troppo elevate,
alterando lequilibrio elettrolitico e le
funzioni metaboliche collegate. La concentrazione
di questi ioni va quindi ridotta ad intervalli
regolari attraverso la dialisi una soluzione
accettore a
bassissima forza ionica usualmente acqua
ultrapura è fatta scorrere lungo una membana
semipermeabile, mentre il sangue del paziente
scorre dallaltro lato della membrana. Gli ioni
diffondono dalla soluzione a maggiore forza
ionica, il sangue, alla soluzione a minore forza
ionica, la quale è rinnovata in continuo per fare
in modo che lequilibrio non sia mai raggiunto e
la migrazione dal sangue sia continua, fino ad
ottenerne la purificazione
57
Dialisi per il latte
Il pretrattamento di campioni di latte a scopo
analitico ha lobiettivo opposto la soluzione
accettore è a contatto con la membrana in
condizioni statiche, in modo che si raggiunga
lequilibrio al quale gli ioni sono totalmente
migrati nella soluzione accettore, la quale può
essere utilizzata per la determinazione degli
analiti ionici in quanto non contiene le sostanze
interferenti Il metodo di dialisi può essere
automatizzato allinterno di un cromatografo
ionico. Il tempo necessario per raggiungere
lequilibrio di
dialisi è di circa 10 minuti, dopo il quale il
campione (cioè la soluzione accettore) è
iniettato in colonna mentre leluizione è in
corso è possibile preparare un nuovo campione con
la dialisi Sulla soluzione trattata con dialisi è
possibile determinare tutte le specie ioniche a
basso peso molecolare, come anioni, cationi e
oligosaccaridi