FABIANA SEIXAS

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BIBLIOTECAS DE DNA ou BANCOS DE DNA
FABIANA SEIXAS email fabianak_at_ufpel.edu.br
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TIPOS DE VETORES
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VETORES PLASMIDIAIS

• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita
  dupla, extracromossômico, que ocorrem
  naturalmente em bactérias e algumas leveduras
• pUC18
• pBR322
• pUP310
• Ob. Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb

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BACTERIÓFAGO

• Vírus que infectam bactérias
• DNA ou RNA
• Capsídeo
• Biologia do fago
• Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

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COSMÍDEOS

• São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos
• - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35
  kb

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DNA RECOMBINANTE
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(No Transcript)
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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

• É uma coleção de clones que representam a
  totalidade do genoma de um determinado organismo
• Consiste de todas as moléculas de DNA
  recombinantes que foram geradas pela ligação do
  DNA do organismo a um vetor (plasmideo,
  bacteriófago ou cosmídeo)
• Servem para isolar DNA específicos de um organismo

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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
CARACTERÍSTICAS

• São usadas principalmente para procariotos
• Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para
  estudo de regiões reguladoras
• Independe do tipo de célula utilizada para a
  obtenção do DNA

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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
- Representa todo o genoma de um organismo
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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Fagos
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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Aplicações
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BIBLIOTECAS DE cDNA
BIBLIOTECAS DE cDNA

• É o conjunto de clones das seqüências
  codificadoras que estão sendo expressas pela
  célula naquele momento, obtido através da
  clonagem de moléculas cópias do mRNA.
• É usada principalmente para células eucarióticas.
• Varia de acordo com o tecido utilizado.

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BIBLIOTECAS DE cDNA
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SINTESE DE cDNA
Purificação do RNA
Hibridização com poly(dT)
Copia do DNA com RT
Degradação do RNA
Síntese de uma fita complementar
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BIBLIOTECAS DE cDNA
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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Clonagem de cDNA em fago ?
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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Etapas na construção de uma Biblioteca genômica e
de cDNA
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BIBLIOTECAS
DIFERENÇAS

• Biblioteca genômica
• Representam uma amostra aleatória de todas as
  seqüências de DNA de um organismo
• Biblioteca de cDNA
• Contém moléculas que foram transcritas em mRNA
• Produção de grande quantidade de mRNA por
  células especializadas
• Varia de acordo com tipo e estado fisiológico
  da célula
• mRNA é processado

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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Utilização de bibliotecas
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TRIAGEM DE UMA BIBLIOTECA

• Detecção do produto do gene pela utilização de
  anticorpos
• Detecção do DNA através da técnica de hibridização

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Triagem de uma biblioteca
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1- Detecção do produto do gene pelo uso de
anticorpos
Triagem de uma biblioteca
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1- Detecção do produto do gene pelo uso de
anticorpos
Triagem de uma biblioteca
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Triagem de uma biblioteca
2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

• É a formação de molécula fita dupla, através do
  pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e
  outra de RNA complementares, mas de origens
  diferentes
• Hibridização ? Renaturação

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Triagem de uma biblioteca
SONDA de DNA - Seqüência de DNA Marcada

• Marcação da Sonda de DNA
• Radioativa 32P nick traslation
• Enzimática peroxidase, fosfatase alcalina

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Triagem de uma biblioteca
Marcação da Sonda de DNA Radioativa 32P nick
traslation
Atividade Exonucleasica da DNA polimerase
DNA polimerase preenche com nucleotídeos marcados
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Triagem de uma biblioteca

• Marcação da Sonda de DNA
• Enzimática peroxidase, fosfatase alcalina

Desnaturação DNA
DNA fita simples
peroxidase complexada com polimero positivo
Ligação Fraca (DNA Peroxidase)
glutaraldeído
Sondas Covalentemente marcada com a enzima
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2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
Triagem de uma biblioteca
Placas com Colônias contendo os plasmídeos
Lise das Bactérias Desnaturação do DNA
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Sonda
Filme de Raio - X
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2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
Triagem de uma biblioteca
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Caracterização da seqüência encontrada
Triagem de uma biblioteca

• Seqüenciamento de DNA
• PCR
• Expressão da sequência codificadora

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Técnicas de Hibridização
Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western
Blot - Proteína
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Southern Blot RNA

• Sonda seqüência de DNA marcada

Transferência de DNA do gel para a membrana
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Northern Blot RNA
4. Geração de uma sonda marcada
1. Extração do DNA
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
pGEM-T
2. Eletroforese do RNA
5. Hibridização
6. Visualização
3. Transferencia para a menbrana
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Trabalho Prático 1