Engenharia Gen

1
BIBLIOTECAS DE DNA
FABIANA SEIXAS email fabianak_at_ufpel.edu.br
2
TIPOS DE VETORES
3
TIPOS DE VETORES
Vetores
Hospedeiros
Utilização
clonagem
Plasmídeos
Bactérias / leveduras
Cosmídeos
Bacteriófagos
4
VETORES PLASMIDIAIS

• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita
  dupla, extracromossômico, que ocorrem
  naturalmente em bactérias e algumas leveduras
• pUC18
• pBR322
• pUP310
• Ob. Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb

5
VETORES PLASMIDIAIS
Plasmídeo
6
BACTERIÓFAGO

• Vírus que infectam bactérias
• DNA ou RNA
• Capsídeo
• Biologia do fago
• Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

7
COSMÍDEOS

• São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos
• - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35
  kb

8
DNA RECOMBINANTE
9
DNA RECOMBINANTE
10
(No Transcript)
11
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

• É uma coleção de clones que representam a
  totalidade do genoma de um determinado organismo
• Consiste de todas as moléculas de DNA
  recombinantes que foram geradas pela ligação do
  DNA do organismo a um vetor (plasmideo,
  bacteriófago ou cosmídeo)
• Servem para isolar DNA específicos de um organismo

12
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
CARACTERÍSTICAS

• São usadas principalmente para procariotos
• Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para
  estudo de regiões reguladoras
• Independe do tipo de célula utilizada para a
  obtenção do DNA

13
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
- Representa todo o genoma de um organismo
14
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
15
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
16
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Aplicações
17
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Bacteriófagos
18
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Cosmídios
19
BIBLIOTECAS DE cDNA
BIBLIOTECAS DE cDNA

• É o conjunto de clones das seqüências
  codificadoras que estão sendo expressas pela
  célula naquele momento, obtido através da
  clonagem de moléculas cópias do mRNA.
• É usada principalmente para células eucarióticas.
• Varia de acordo com o tecido utilizado.

20
BIBLIOTECAS DE cDNA
21
SINTESE DE cDNA
Purificação do RNA
Hibridização com poly(dT)
Copia do DNA com RT
Degradação do RNA
Síntese de uma fita complementar
22
BIBLIOTECAS DE cDNA
23
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Clonagem de cDNA em fago ?
24
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Etapas na construção de uma Biblioteca genômica e
de cDNA
25
BIBLIOTECAS
DIFERENÇAS

• Biblioteca genômica
• Representam uma amostra aleatória de todas as
  seqüências de DNA de um organismo
• Biblioteca de cDNA
• Contém moléculas que foram transcritas em mRNA
• Produção de grande quantidade de mRNA por
  células especializadas
• Varia de acordo com tipo e estado fisiológico
  da célula
• mRNA é processado

26
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Utilização de bibliotecas
27
TRIAGEM DE UMA BIBLIOTECA

• Detecção do produto do gene pela utilização de
  anticorpos
• Detecção do DNA através da técnica de hibridização

28
Triagem de uma biblioteca
29
1- Detecção do produto do gene pelo uso de
anticorpos
Triagem de uma biblioteca
30
1- Detecção do produto do gene pelo uso de
anticorpos
Triagem de uma biblioteca
31
Triagem de uma biblioteca
2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

• É a formação de molécula fita dupla, através do
  pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e
  outra de RNA complementares, mas de origens
  diferentes
• Hibridização ? Renaturação

32
Triagem de uma biblioteca
SONDA de DNA - Seqüência de DNA Marcada

• Marcação da Sonda de DNA
• Radioativa 32P nick traslation
• Enzimática peroxidase, fosfatase alcalina

33
Triagem de uma biblioteca
Marcação da Sonda de DNA Radioativa 32P nick
traslation
Atividade Exonucleasica da DNA polimerase
DNA polimerase preenche com nucleotídeos marcados
34
Triagem de uma biblioteca

• Marcação da Sonda de DNA
• Enzimática peroxidase, fosfatase alcalina

Desnaturação DNA
DNA fita simples
peroxidase complexada com polimero positivo
Ligação Fraca (DNA Peroxidase)
glutaraldeído
Sondas Covalentemente marcada com a enzima
35
2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
Triagem de uma biblioteca
Placas com Colônias contendo os plasmídeos
Lise das Bactérias Desnaturação do DNA
1
3
2
4
5
6
Sonda
Filme de Raio - X
36
2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
Triagem de uma biblioteca
37
Caracterização da seqüência encontrada
Triagem de uma biblioteca

• Seqüenciamento de DNA
• PCR
• Expressão da sequência codificadora

38
Técnicas de Hibridização
Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western
Blot - Proteína
39
Southern Blot RNA

• Sonda seqüência de DNA marcada

Transferência de DNA do gel para a membrana
40
Northern Blot RNA
4. Geração de uma sonda marcada
1. Extração do DNA
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
pGEM-T
2. Eletroforese do RNA
5. Hibridização
6. Visualização
3. Transferencia para a menbrana
41
Seminários
42
BIBLIOTECAS DE cDNA
Síntese de cDNA fita dupla